24小时热门版块排行榜

返回列表

当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

liuyu_sdili

木虫 (正式写手)

MolEPI: 1
应助: 53 (初中生)
金币: 3045.9
散金: 15
红花: 2
帖子: 394
在线: 311.7小时
虫号: 1130112
注册: 2010-10-23
性别: GG
专业: 微生物生理与生物化学

[求助] 求助：一端为黏性末端一端为平末端的克隆已有1人参与

需要做一个一端为黏性末端一端为平末端的克隆，求教下面几个问题？
1. 如果我用pfu扩增的话，那么是不是可以使用pfu扩增形成的平末端而不用加产生平末端的酶切位点？
2. 我使用的两个限制酶都购自Takara，一个是SnaB I，另外一个是NotI，请问这两个酶使用时需要注意什么？
3.酶是Fermentas的T4连接酶，说明书上是22℃反应，但是很多人用16℃跟4℃，请问那个效果好些？需要连接多长时间？像我这种情况是不是需要用平末端的连接条件（加入PEG）？

回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

平末端连接做不出来克隆已经有30人回复
虚心请教关于平—粘末端的连接问题已经有18人回复
【求助】David书中Cp物性数据和fluent自带的为什么不一致？已经有10人回复
【求助/交流】酶切后的粘性末端补平已经有4人回复
谁做过pEASY-Blunt Cloning啊？谁做过平末端连接啊？已经有7人回复
【求助/交流】请问做抗菌实验很费钱吗？已经有10人回复
【求助】药物载体接上PEG，在PEG的另一端接上叶酸作为配体。PEG和叶酸直接用腙键可以� 已经有3人回复
【求助】锂电池循环伏安是一条水平直线，问题出在哪里已经有17人回复
【求助/交流】粘性末端连接问题已经有12人回复
【求助/交流】平末端必须去磷酸化吗已经有6人回复
【求助/交流】关于平末端连接已经有25人回复

1楼 2012-08-16 18:26:10

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

aofeng860308

木虫 (正式写手)

应助: 53 (初中生)
金币: 3661.4
散金: 145
红花: 5
帖子: 497
在线: 531.1小时
虫号: 938003
注册: 2010-01-06
性别: GG
专业: 环境分析化学

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
liuyu_sdili: 金币+5, ★★★★★最佳答案, 谢谢，过来人说话就是不一样~~~ 2012-08-18 20:16:11
小丹木木: 金币+3, 鼓励积极应助，解答问题 2012-08-20 13:43:26

前两个月刚做过一平一粘的连接，和楼主分享一下。
1、pfu出来的就是平末端，所以个人觉得不需要在加入酶切位点。
2、takara上有关于两种酶的buffer选择问题，不过我没有找到SnaBI和NotI双酶切的相关资料。不过这两个酶切都需要加BSA的。
3、fermentas的T4 ligase22℃连接效果很好，我做的时候是使用22℃2个小时做的一平一粘的连接，加入PEG了的。再不行可以4℃过夜，再22℃连接2小时试试。

赞一下