应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助：一端为黏性末端一端为平末端的克隆
51/1返回列表
查看: 2549  |  回复: 9
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

liuyu_sdili

木虫 (正式写手)

[求助] 求助：一端为黏性末端一端为平末端的克隆 已有1人参与

需要做一个一端为黏性末端一端为平末端的克隆，求教下面几个问题？
1. 如果我用pfu扩增的话，那么是不是可以使用pfu扩增形成的平末端而不用加产生平末端的酶切位点？
2. 我使用的两个限制酶都购自Takara，一个是SnaB I，另外一个是NotI，请问这两个酶使用时需要注意什么？
3.酶是Fermentas的T4连接酶，说明书上是22℃反应，但是很多人用16℃跟4℃，请问那个效果好些？需要连接多长时间？像我这种情况是不是需要用平末端的连接条件（加入PEG）？
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2012-08-16 18:26:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

aofeng860308

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
liuyu_sdili: 金币+5, ★★★★★最佳答案, 谢谢，过来人说话就是不一样~~~ 2012-08-18 20:16:11
小丹木木: 金币+3, 鼓励积极应助，解答问题 2012-08-20 13:43:26
前两个月刚做过一平一粘的连接，和楼主分享一下。
1、pfu出来的就是平末端，所以个人觉得不需要在加入酶切位点。
2、takara上有关于两种酶的buffer选择问题，不过我没有找到SnaBI和NotI双酶切的相关资料。不过这两个酶切都需要加BSA的。
3、fermentas的T4 ligase22℃连接效果很好，我做的时候是使用22℃2个小时做的一平一粘的连接，加入PEG了的。再不行可以4℃过夜，再22℃连接2小时试试。
赞一下 回复此楼
8楼2012-08-18 19:17:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 10 个回答

liuyu_sdili

木虫 (正式写手)
补充一个问题：这种情况需要载体去磷酸化吗？
赞一下 回复此楼
2楼2012-08-16 18:29:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

mitocam

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+5, 鼓励积极应助，解答问题 2012-08-17 13:48:19
liuyu_sdili: 金币+4, ★★★很有帮助, 谢谢 交流经验 2012-08-17 15:35:16
需要做一个一端为黏性末端一端为平末端的克隆，求教下面几个问题？
1. 如果我用pfu扩增的话，那么是不是可以使用pfu扩增形成的平末端而不用加产生平末端的酶切位点？

理论上可以，但不知DNA聚合酶扩增时会不会丢失一两个碱基。可以试一试。

2. 我使用的两个限制酶都购自Takara，一个是SnaB I，另外一个是NotI，请问这两个酶使用时需要注意什么？
没用过SnaBI，NotI是常用酶，按照说明书就行了。 用对buffer能否同时使用两个酶，他们的实用温度一样不？

3.酶是Fermentas的T4连接酶，说明书上是22℃反应，但是很多人用16℃跟4℃，请问那个效果好些？需要连接多长时间？像我这种情况是不是需要用平末端的连接条件（加入PEG）？

我用NEB的T4，通常25倍稀释在水中（短时间）用于连接，通常室温 23C过夜，如果着急，3－4小时也可以。我一直都有用PEG。

这种情况需要载体去磷酸化吗？

不用。
赞一下 回复此楼
3楼2012-08-16 21:26:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

qiaoxianying

银虫 (初入文坛)
T4连接酶一般的连接温度是13度到16度过夜，我经常做
赞一下 回复此楼
4楼2012-08-17 07:11:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 10 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭