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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助：一端为黏性末端一端为平末端的克隆
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liuyu_sdili

木虫 (正式写手)

[求助] 求助：一端为黏性末端一端为平末端的克隆 已有1人参与

需要做一个一端为黏性末端一端为平末端的克隆，求教下面几个问题？
1. 如果我用pfu扩增的话，那么是不是可以使用pfu扩增形成的平末端而不用加产生平末端的酶切位点？
2. 我使用的两个限制酶都购自Takara，一个是SnaB I，另外一个是NotI，请问这两个酶使用时需要注意什么？
3.酶是Fermentas的T4连接酶，说明书上是22℃反应，但是很多人用16℃跟4℃，请问那个效果好些？需要连接多长时间？像我这种情况是不是需要用平末端的连接条件（加入PEG）？
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1楼 2012-08-16 18:26:10
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mitocam

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+5, 鼓励积极应助，解答问题 2012-08-17 13:48:19
liuyu_sdili: 金币+4, ★★★很有帮助, 谢谢 交流经验 2012-08-17 15:35:16
需要做一个一端为黏性末端一端为平末端的克隆，求教下面几个问题？
1. 如果我用pfu扩增的话，那么是不是可以使用pfu扩增形成的平末端而不用加产生平末端的酶切位点？

理论上可以，但不知DNA聚合酶扩增时会不会丢失一两个碱基。可以试一试。

2. 我使用的两个限制酶都购自Takara，一个是SnaB I，另外一个是NotI，请问这两个酶使用时需要注意什么？
没用过SnaBI，NotI是常用酶，按照说明书就行了。 用对buffer能否同时使用两个酶，他们的实用温度一样不？

3.酶是Fermentas的T4连接酶，说明书上是22℃反应，但是很多人用16℃跟4℃，请问那个效果好些？需要连接多长时间？像我这种情况是不是需要用平末端的连接条件（加入PEG）？

我用NEB的T4，通常25倍稀释在水中（短时间）用于连接，通常室温 23C过夜，如果着急，3－4小时也可以。我一直都有用PEG。

这种情况需要载体去磷酸化吗？

不用。
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3楼2012-08-16 21:26:10
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liuyu_sdili

木虫 (正式写手)
补充一个问题：这种情况需要载体去磷酸化吗？
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2楼2012-08-16 18:29:25
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qiaoxianying

银虫 (初入文坛)
T4连接酶一般的连接温度是13度到16度过夜，我经常做
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4楼2012-08-17 07:11:40
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liuyu_sdili

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by mitocam at 2012-08-16 21:26:10
需要做一个一端为黏性末端一端为平末端的克隆，求教下面几个问题？
1. 如果我用pfu扩增的话，那么是不是可以使用pfu扩增形成的平末端而不用加产生平末端的酶切位点？

理论上可以，但不知DNA聚合酶扩增时会不会丢 ...

您的意思是平端连接一直用PEG，而粘末端连接不用是吧~~~
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7楼2012-08-18 17:31:41
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