| 查看: 3419 | 回复: 14 | ||||
liuwei0824新虫 (初入文坛)
|
[求助]
关于平末端连接 已有3人参与
|
|||
|
大家好！我最近在做平末端连接的实验，总是做不成功，求教~~ 载体是用smal1酶切的平末端，片段是双酶切的粘性末端，酶切后，载体进行去磷酸化，片段进行末端补平，然后进行连接反应（16℃过夜），然后转化，平板上都不长菌。。。。 一开始载体是在30度酶切2h，片段在37度酶切2h，跑电泳后发现，载体只是部分被切开了，然后酶切时间就改成了过夜，结果都切没了，，， 所有的酶都用的是Takara公司的。 求高人指点啊！！！谢谢啦O(∩_∩)O~ |
回复此楼» 猜你喜欢
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有216人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 将含精氨酸，赖氨酸的多肽用EDC反应连接到PLA的末端羧基上
已经有5人回复
- 一个平末端和粘性末端怎样连接比较好
已经有8人回复
- 求助：一端为黏性末端一端为平末端的克隆
已经有9人回复
- 平端 影响连接吗
已经有8人回复
- 平末端连接，连上了，很多转化子中没有一个正确的，怎么办？
已经有13人回复
- 关于酶切后的连接问题，共同探讨共同进步
已经有18人回复
- 双酶切粘性末端连接不上
已经有21人回复
- 平末端连接做不出来克隆
已经有30人回复
- 虚心请教关于平—粘末端的连接问题
已经有18人回复
- 分子克隆连接问题！
已经有12人回复
- 谁做过pEASY-Blunt Cloning啊？谁做过平末端连接啊？
已经有7人回复
- 求助！请问 NdeI 和EcoRI 同时做酶切可以吗？
已经有3人回复
- 【求助/交流】求平末端的连接体系！
已经有5人回复
- 【求助/交流】T-DNA全长约10000bp能否转入植物基因组。
已经有22人回复
- 【求助/交流】关于酶切产物连接的一点问题
已经有13人回复
- 【求助/交流】粘性末端连接问题
已经有12人回复
- 【求助/交流】关于平末端连接
已经有25人回复
- 谁做过adaptor 衔接子
已经有6人回复
biostar2009
专家顾问 (正式写手)
-
专家经验: +220 - MolEPI: 20
- 应助: 231 (大学生)
- 金币: 10391.9
- 散金: 387
- 红花: 63
- 帖子: 540
- 在线: 151.9小时
- 虫号: 2811882
- 注册: 2013-11-19
- 专业: 生物化学
- 管辖: 分子生物
【答案】应助回帖
|
4楼说得很有道理！ 你没有搞懂平末端化的原理就刚做这种“非主流”的克隆，勇气可嘉。 Klenow Fragment说到底是个DNA polymerase，相当于引物扩增，只能从5’-3‘方向进行。 大部分常用的限制性内切酶都是5'突出的，也就是缩进去的那个free的是3’末端，这样就可以补平 但是对于3‘突出的限制性内切酶，缩进去的是5’末端，这个就不能继续用Klenow Fragment的正向反应了。 解决之道很简单，就是Klenow Fragment还有一个3‘-5’的核酸外切酶活性，就是不加dNTP，可以把5‘突出的切平。 专业干这活的是T4 DNA polymerase，活性比Klenow Fragment高很多，但是我一直就用Klenow也行。 我喜欢在切片之后再加点dNTP让它补平，因为切到平齐的时候实际上进行的是一个交换反应。 但是，如果你说酶切过夜，载体就没了，这个相当不正常。 |
6楼2014-03-25 19:43:13
zhaodahe
木虫 (正式写手)
- MolEPI: 1
- 应助: 220 (大学生)
- 金币: 1796.6
- 红花: 7
- 帖子: 461
- 在线: 378.5小时
- 虫号: 552612
- 注册: 2008-04-30
- 性别: GG
- 专业: 微生物遗传学
4楼2012-12-24 12:35:12
781055707
木虫 (著名写手)
- 应助: 291 (大学生)
- 金币: 3118.2
- 散金: 46
- 红花: 19
- 帖子: 2030
- 在线: 579.3小时
- 虫号: 3046113
- 注册: 2014-03-13
- 性别: GG
- 专业: 生物大分子结构与功能
14楼2017-05-04 08:44:58
zhaodahe
木虫 (正式写手)
- MolEPI: 1
- 应助: 220 (大学生)
- 金币: 1796.6
- 红花: 7
- 帖子: 461
- 在线: 378.5小时
- 虫号: 552612
- 注册: 2008-04-30
- 性别: GG
- 专业: 微生物遗传学
2楼2012-12-18 12:23:31
liuwei0824
新虫 (初入文坛)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 80.4
- 红花: 1
- 帖子: 41
- 在线: 18.3小时
- 虫号: 1395495
- 注册: 2011-09-08
- 性别: MM
- 专业: 植物病理学
3楼2012-12-21 16:15:17
5楼2014-03-25 19:07:03
biostar2009
专家顾问 (正式写手)
-
专家经验: +220 - MolEPI: 20
- 应助: 231 (大学生)
- 金币: 10391.9
- 散金: 387
- 红花: 63
- 帖子: 540
- 在线: 151.9小时
- 虫号: 2811882
- 注册: 2013-11-19
- 专业: 生物化学
- 管辖: 分子生物
7楼2014-03-25 19:44:10
8楼2016-01-15 10:39:14
biostar2009
专家顾问 (正式写手)
-
专家经验: +220 - MolEPI: 20
- 应助: 231 (大学生)
- 金币: 10391.9
- 散金: 387
- 红花: 63
- 帖子: 540
- 在线: 151.9小时
- 虫号: 2811882
- 注册: 2013-11-19
- 专业: 生物化学
- 管辖: 分子生物
9楼2016-01-15 14:33:35
10楼2016-01-15 18:08:06
