应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于平末端连接
52/1返回列表
查看: 3376  |  回复: 14
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

liuwei0824

新虫 (初入文坛)

[求助] 关于平末端连接 已有3人参与

大家好！我最近在做平末端连接的实验，总是做不成功，求教~~
     载体是用smal1酶切的平末端，片段是双酶切的粘性末端，酶切后，载体进行去磷酸化，片段进行末端补平，然后进行连接反应（16℃过夜），然后转化，平板上都不长菌。。。。
   一开始载体是在30度酶切2h，片段在37度酶切2h，跑电泳后发现，载体只是部分被切开了，然后酶切时间就改成了过夜，结果都切没了，，，
   所有的酶都用的是Takara公司的。

   求高人指点啊！！！谢谢啦O(∩_∩)O~
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2012-12-18 10:31:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

781055707

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

你可以在你的目的片段的引物上加平末端酶切位点，这样就不用多一步末端补平了，分子实验，操作步骤不要太多，能简就减。
赞一下(1人) 回复此楼
采菊东篱下，悠然见南山。
14楼2017-05-04 08:44:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 15 个回答

zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-12-24 19:04:41
片段的双酶切用的是哪两个酶？看一下酶切后的粘性末端是5‘突出还是3’突出。还有就是一个转化子都不长，可能是去磷酸化很干净，或者有可能是感受态不好，建议做个不去磷酸化的线性质粒做连接、转化做阳性对照。
赞一下 回复此楼
2楼2012-12-18 12:23:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

liuwei0824

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhaodahe at 2012-12-18 12:23:31
片段的双酶切用的是哪两个酶？看一下酶切后的粘性末端是5‘突出还是3’突出。还有就是一个转化子都不长，可能是去磷酸化很干净，或者有可能是感受态不好，建议做个不去磷酸化的线性质粒做连接、转化做阳性对照。

谢谢你O(∩_∩)O~
片段酶切用的是sacI和 salI，粘性末端5‘突出和3’突出会有很大的区别吗？
下次准备做不去磷酸化的对照，O(∩_∩)O~
但是这一次的实验还是很失败
赞一下 回复此楼
3楼2012-12-21 16:15:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-12-24 19:04:58
引用回帖:
3楼: Originally posted by liuwei0824 at 2012-12-21 16:15:17
谢谢你O(∩_∩)O~
片段酶切用的是sacI和 salI，粘性末端5‘突出和3’突出会有很大的区别吗？
下次准备做不去磷酸化的对照，O(∩_∩)O~
但是这一次的实验还是很失败...

粘性末端补平应该是用聚合酶孵化，而聚合酶大多是有方向性的，如果是3’粘性末端，好像是不行的，当然也要看你用的是什么聚合酶。
我刚查了一下，SacI是3‘粘性末端，你做不出结果，问题可能在这。
建议你还是换个酶切位点。
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2012-12-24 12:35:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 15 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 材料调剂 +4 爱擦汗的可乐冰 2026-02-28 4/200 2026-03-01 00:38 by 猫猫球alter
[基金申请] 面上模板改不了页边距吧？ +5 ieewxg 2026-02-25 6/300 2026-03-01 00:10 by addressing
[考研] 304求调剂 +3 52hz~~ 2026-02-28 5/250 2026-03-01 00:00 by 52hz~~
[考研] 317一志愿华南理工电气工程求调剂 +5 Soliloquy_Q 2026-02-28 8/400 2026-02-28 23:36 by xyx2012xyx
[考研] 292求调剂 +3 yhk_819 2026-02-28 3/150 2026-02-28 21:57 by gaoxiaoniuma
[考研] 290求调剂 +5 材料专硕调剂； 2026-02-28 6/300 2026-02-28 21:40 by gaoxiaoniuma
[考研] 264求调剂 +3 巴拉巴拉根556 2026-02-28 3/150 2026-02-28 21:31 by gaoxiaoniuma
[考研] 材料类求调剂 +6 wana_kiko 2026-02-28 6/300 2026-02-28 21:20 by gaoxiaoniuma
[考研] 求调剂 +4 repeatt?t 2026-02-28 4/200 2026-02-28 21:16 by gaoxiaoniuma
[考研] 284求调剂 +4 天下熯 2026-02-28 4/200 2026-02-28 21:13 by gaoxiaoniuma
[考研] 0856材料求调剂 +10 hyf hyf hyf 2026-02-28 11/550 2026-02-28 18:50 by 无际的草原
[考研] 285求调剂 +5 满头大汗的学生 2026-02-28 5/250 2026-02-28 18:10 by 材料专硕调剂；
[高分子] 求环氧树脂研发1名 +3 孙xc 2026-02-25 11/550 2026-02-28 16:57 by ichall
[考研] 265分求调剂不调专业和学校有行学上就 +4 礼堂丁真258 2026-02-28 6/300 2026-02-28 16:18 by 求调剂zz
[考研] 0856调剂 +3 刘梦微 2026-02-28 3/150 2026-02-28 13:22 by houyaoxu
[考研] 寻找调剂 +3 LYidhsjabdj 2026-02-28 3/150 2026-02-28 12:59 by miniwendy
[考研] 304求调剂 +5 曼殊2266 2026-02-28 6/300 2026-02-28 12:44 by 迷糊CCPs
[硕博家园] 博士自荐 +6 科研狗111 2026-02-26 9/450 2026-02-28 12:32 by seaskyy
[考研] 298求调剂 +4 axyz3 2026-02-28 4/200 2026-02-28 11:21 by wang_dand
[硕博家园] 【博士招生】太原理工大学2026化工博士 +4 N1ce_try 2026-02-24 8/400 2026-02-26 08:40 by N1ce_try
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭