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liuwei0824

新虫 (初入文坛)

[求助] 关于平末端连接 已有3人参与

大家好!我最近在做平末端连接的实验,总是做不成功,求教~~
     载体是用smal1酶切的平末端,片段是双酶切的粘性末端,酶切后,载体进行去磷酸化,片段进行末端补平,然后进行连接反应(16℃过夜),然后转化,平板上都不长菌。。。。
   一开始载体是在30度酶切2h,片段在37度酶切2h,跑电泳后发现,载体只是部分被切开了,然后酶切时间就改成了过夜,结果都切没了,,,
   所有的酶都用的是Takara公司的。

   求高人指点啊!!!谢谢啦O(∩_∩)O~
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ytetyio09

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

可以试试这篇论文的方法,虽然是个小的改进,但是值得一试,而且很方便:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24613256
5楼2014-03-25 19:07:03
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-12-24 19:04:41
片段的双酶切用的是哪两个酶?看一下酶切后的粘性末端是5‘突出还是3’突出。还有就是一个转化子都不长,可能是去磷酸化很干净,或者有可能是感受态不好,建议做个不去磷酸化的线性质粒做连接、转化做阳性对照。
2楼2012-12-18 12:23:31
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liuwei0824

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by zhaodahe at 2012-12-18 12:23:31
片段的双酶切用的是哪两个酶?看一下酶切后的粘性末端是5‘突出还是3’突出。还有就是一个转化子都不长,可能是去磷酸化很干净,或者有可能是感受态不好,建议做个不去磷酸化的线性质粒做连接、转化做阳性对照。

谢谢你O(∩_∩)O~
片段酶切用的是sacI和 salI,粘性末端5‘突出和3’突出会有很大的区别吗?
下次准备做不去磷酸化的对照,O(∩_∩)O~
但是这一次的实验还是很失败
3楼2012-12-21 16:15:17
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-12-24 19:04:58
引用回帖:
3楼: Originally posted by liuwei0824 at 2012-12-21 16:15:17
谢谢你O(∩_∩)O~
片段酶切用的是sacI和 salI,粘性末端5‘突出和3’突出会有很大的区别吗?
下次准备做不去磷酸化的对照,O(∩_∩)O~
但是这一次的实验还是很失败...

粘性末端补平应该是用聚合酶孵化,而聚合酶大多是有方向性的,如果是3’粘性末端,好像是不行的,当然也要看你用的是什么聚合酶。
我刚查了一下,SacI是3‘粘性末端,你做不出结果,问题可能在这。
建议你还是换个酶切位点。
4楼2012-12-24 12:35:12
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