24小时热门版块排行榜    

查看: 3401  |  回复: 14
当前只显示满足指定条件的回帖,点击这里查看本话题的所有回帖

liuwei0824

新虫 (初入文坛)

[求助] 关于平末端连接 已有3人参与

大家好!我最近在做平末端连接的实验,总是做不成功,求教~~
     载体是用smal1酶切的平末端,片段是双酶切的粘性末端,酶切后,载体进行去磷酸化,片段进行末端补平,然后进行连接反应(16℃过夜),然后转化,平板上都不长菌。。。。
   一开始载体是在30度酶切2h,片段在37度酶切2h,跑电泳后发现,载体只是部分被切开了,然后酶切时间就改成了过夜,结果都切没了,,,
   所有的酶都用的是Takara公司的。

   求高人指点啊!!!谢谢啦O(∩_∩)O~
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐,对您同样有帮助:

已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ytetyio09

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

可以试试这篇论文的方法,虽然是个小的改进,但是值得一试,而且很方便:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24613256
5楼2014-03-25 19:07:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 15 个回答

zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-12-24 19:04:41
片段的双酶切用的是哪两个酶?看一下酶切后的粘性末端是5‘突出还是3’突出。还有就是一个转化子都不长,可能是去磷酸化很干净,或者有可能是感受态不好,建议做个不去磷酸化的线性质粒做连接、转化做阳性对照。
2楼2012-12-18 12:23:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

liuwei0824

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by zhaodahe at 2012-12-18 12:23:31
片段的双酶切用的是哪两个酶?看一下酶切后的粘性末端是5‘突出还是3’突出。还有就是一个转化子都不长,可能是去磷酸化很干净,或者有可能是感受态不好,建议做个不去磷酸化的线性质粒做连接、转化做阳性对照。

谢谢你O(∩_∩)O~
片段酶切用的是sacI和 salI,粘性末端5‘突出和3’突出会有很大的区别吗?
下次准备做不去磷酸化的对照,O(∩_∩)O~
但是这一次的实验还是很失败
3楼2012-12-21 16:15:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-12-24 19:04:58
引用回帖:
3楼: Originally posted by liuwei0824 at 2012-12-21 16:15:17
谢谢你O(∩_∩)O~
片段酶切用的是sacI和 salI,粘性末端5‘突出和3’突出会有很大的区别吗?
下次准备做不去磷酸化的对照,O(∩_∩)O~
但是这一次的实验还是很失败...

粘性末端补平应该是用聚合酶孵化,而聚合酶大多是有方向性的,如果是3’粘性末端,好像是不行的,当然也要看你用的是什么聚合酶。
我刚查了一下,SacI是3‘粘性末端,你做不出结果,问题可能在这。
建议你还是换个酶切位点。
4楼2012-12-24 12:35:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 268求调剂 +3 简单点0 2026-03-17 3/150 2026-03-17 23:15 by wangjihu
[基金申请] 被我言中:新模板不强调格式了,假专家开始管格式了 +4 beefly 2026-03-14 4/200 2026-03-17 22:04 by 黄鸟于飞Chao
[考研] 085601专硕,总分342求调剂,地区不限 +4 share_joy 2026-03-16 4/200 2026-03-17 21:32 by hmn_wj
[考研] 268求调剂 +7 好运连绵不绝 2026-03-12 8/400 2026-03-17 20:28 by xilongliang
[考研] 本人考085602 化学工程 专硕 +16 不知道叫什么! 2026-03-15 18/900 2026-03-17 17:05 by ruiyingmiao
[考研] 290求调剂 +6 孔志浩 2026-03-12 11/550 2026-03-17 14:41 by 周舟舟77
[考研] 289求调剂 +6 步川酷紫123 2026-03-11 6/300 2026-03-17 10:23 by Sammy2
[考研] 材料与化工304求B区调剂 +7 邱gl 2026-03-11 8/400 2026-03-17 09:36 by 努力学习赚彩礼
[考研] 274求调剂 +5 时间点 2026-03-13 5/250 2026-03-17 07:34 by 热情沙漠
[考研] 药学383 求调剂 +3 药学chy 2026-03-15 4/200 2026-03-16 20:51 by 元子^0^
[考研] 环境工程调剂 +6 大可digkids 2026-03-16 6/300 2026-03-16 17:16 by barlinike
[考研] 一志愿211 0703方向310分求调剂 +3 努力奋斗112 2026-03-15 3/150 2026-03-16 16:44 by houyaoxu
[考研] 招收0805(材料)调剂 +3 18595523086 2026-03-13 3/150 2026-03-14 00:33 by 123%、
[考研] 材料与化工(0856)304求B区调剂 +6 邱gl 2026-03-12 7/350 2026-03-13 23:24 by 邱gl
[考研] 材料371求调剂 +9 鳄鱼? 2026-03-11 11/550 2026-03-13 22:53 by JourneyLucky
[考研] 0856材料与化工301求调剂 +5 奕束光 2026-03-13 5/250 2026-03-13 22:00 by 星空星月
[考研] 求调剂 +5 一定有学上- 2026-03-12 5/250 2026-03-13 18:31 by ms629
[考研] 材料专硕350 求调剂 +4 王金科 2026-03-12 4/200 2026-03-13 16:02 by ruiyingmiao
[考研] 0817化学工程与技术考研312分调剂 +3 T123 tt 2026-03-12 3/150 2026-03-13 10:49 by houyaoxu
[考博] 2026年博士申请 +3 QwQwQW10 2026-03-11 3/150 2026-03-12 17:58 by gxch43
信息提示
请填处理意见