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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 存档旧帖 » 连接表达载体后的检测问题
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蛋白之家

新虫 (小有名气)

[交流] 连接表达载体后的检测问题

最近一直在做酶切，连接，以及检测
但是发现一些问题，想咨询大家，最近结果如下：
1. 酶切后连接，这部分做的比较稳定，长斑情况虽不是特别多，只有那么几个
2.将长好的斑摇菌后，提质粒，质粒PCR，都有合适的条带
3.不加模板，PCR的结果很郁闷，一共4个基因，1号基因扩出来了，2,3,4，没有
4.将空载体作为模板，PCR的结果：1,2,3,4都有条带，但2的条带比目的条带偏小，3比目的条带偏大，1和4的条带看着和目的条带大小一样。

现在的问题是：不明白为什么空载体能扩出来东西？如果说我的引物污染了，那不加模板也应该是能扩出来东西的；用的是生工买的PCR mix  
现在这些结果真是让人郁闷，希望大家帮忙分析一下这个情况该如何
是不是得重新开始？
谢谢
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1楼 2012-12-02 11:49:53
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wangqi20092

新虫 (小有名气)
★
蛋白之家(金币+1): 谢谢参与
把图片发过来看看，空载体都能出条带，如果引物没污染，那就是你的空载体不是空载体，所以想办法确定是空载体。
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2楼2012-12-02 12:19:29
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sarah-miao

银虫 (正式写手)
★
蛋白之家(金币+1): 谢谢参与
发图给大家看看，可以帮忙解决问题哈

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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3楼2012-12-02 12:57:51
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Marado

金虫 (正式写手)
★
蛋白之家(金币+1): 谢谢参与
PCR验证本就不可靠，为嘛不做酶切，酶切不是一目了然麽……比PCR可靠多了.
空载也有可能扩出条带的，我就被坑过一次，所以之后都不信任PCR验证了.
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4楼2012-12-02 13:42:12
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★
蛋白之家(金币+1): 谢谢参与
你质粒大小对吗？PCR鉴定可以用，一般用于大量粗筛。不过你只有几个克隆，又提了质粒，做酶切鉴定更靠谱。
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5楼2012-12-03 04:08:06
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蛋白之家

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-03 04:08:06
你质粒大小对吗？PCR鉴定可以用，一般用于大量粗筛。不过你只有几个克隆，又提了质粒，做酶切鉴定更靠谱。

昨天试过酶切了  酶切能切出合适的条带 这样是不是就可以继续后续试验了？用不用测序
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6楼2012-12-03 10:16:25
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蛋白之家

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by Marado at 2012-12-02 13:42:12
PCR验证本就不可靠，为嘛不做酶切，酶切不是一目了然麽……比PCR可靠多了.
空载也有可能扩出条带的，我就被坑过一次，所以之后都不信任PCR验证了.

我做了酶切  酶切跑胶条带合适   不知道能不能继续后续试验
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7楼2012-12-03 10:16:52
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 蛋白之家 at 2012-12-03 10:16:25
昨天试过酶切了  酶切能切出合适的条带 这样是不是就可以继续后续试验了？用不用测序...

需不需要测序要看你克隆的目的。比方说你想做表达的话是需要测序的。一般是先酶切鉴定正确后测序。
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8楼2012-12-03 12:15:16
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蛋白之家

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-03 12:15:16
需不需要测序要看你克隆的目的。比方说你想做表达的话是需要测序的。一般是先酶切鉴定正确后测序。...

今天将另外两个没有切好的重新提了质粒，结果质粒浓度太低了，才20ng/ul 结果没切不出来东西   
我想做个表达，但以前测表达载体的序列 总是测不出来啊   不知道为什么
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9楼2012-12-03 14:21:40
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amilie030312

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
蛋白之家(金币+1): 谢谢参与
小丹木木: 金币+3, 鼓励交流 2012-12-03 16:43:21
上面说的很有道理，应该酶切，PCR检测的结果不一定可靠，有污染、有杂带、有····的都能扩出假阳性出来，所以酶切的结果更加可信。
你怎么样判断空载呢，如果前面双切的质粒空载的可能性很小，可能就不是空载。
如果可以就测个序吧，另外，如果还要做下游实验建议不要乱用PCR酶，要用保真度较高的酶，不然容易出现错配。
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10楼2012-12-03 16:35:48
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
9楼: Originally posted by 蛋白之家 at 2012-12-03 14:21:40
今天将另外两个没有切好的重新提了质粒，结果质粒浓度太低了，才20ng/ul 结果没切不出来东西   
我想做个表达，但以前测表达载体的序列 总是测不出来啊   不知道为什么...

20ng/ul是不高，如果你用的是表达载体的话是有可能的。一般表达载体的质粒拷贝数不是很高，一般多收些菌裂解才能勉强达到提克隆载体质粒的的浓度。此外，你用的什么受体菌？一般做表达是先把克隆转化到克隆菌株后测序正确后再转化质粒到表达菌株。
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11楼2012-12-04 07:44:08
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蛋白之家

新虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-04 07:44:08
20ng/ul是不高，如果你用的是表达载体的话是有可能的。一般表达载体的质粒拷贝数不是很高，一般多收些菌裂解才能勉强达到提克隆载体质粒的的浓度。此外，你用的什么受体菌？一般做表达是先把克隆转化到克隆菌株后测 ...

载体：pET28a   感受态： BL21(DE3)
我昨天也想到了这个裂解的问题  最近不是天凉了么 SDS出现白色沉淀了， 今天将其加热溶解后再重新提质粒  然后看效果
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12楼2012-12-04 08:25:56
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你做好鉴定前最好把质粒转到DH5α里。测序正确后再转到BL21。BL21不适合长时间保存质粒。裂解用的SDS如果出现沉淀，可以加热到37°C至沉淀完全溶解。
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13楼2012-12-04 08:35:15
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蛋白之家

新虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-04 08:35:15
你做好鉴定前最好把质粒转到DH5α里。测序正确后再转到BL21。BL21不适合长时间保存质粒。裂解用的SDS如果出现沉淀，可以加热到37°C至沉淀完全溶解。

嗯   好的  谢谢
我试着重新做一下
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14楼2012-12-04 17:22:40
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