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蛋白之家

新虫 (小有名气)


[交流] 连接表达载体后的检测问题

最近一直在做酶切,连接,以及检测
但是发现一些问题,想咨询大家,最近结果如下:
1. 酶切后连接,这部分做的比较稳定,长斑情况虽不是特别多,只有那么几个
2.将长好的斑摇菌后,提质粒,质粒PCR,都有合适的条带
3.不加模板,PCR的结果很郁闷,一共4个基因,1号基因扩出来了,2,3,4,没有
4.将空载体作为模板,PCR的结果:1,2,3,4都有条带,但2的条带比目的条带偏小,3比目的条带偏大,1和4的条带看着和目的条带大小一样。

现在的问题是:不明白为什么空载体能扩出来东西?如果说我的引物污染了,那不加模板也应该是能扩出来东西的;用的是生工买的PCR mix  
现在这些结果真是让人郁闷,希望大家帮忙分析一下这个情况该如何
是不是得重新开始?
谢谢
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蛋白之家

新虫 (小有名气)


引用回帖:
4楼: Originally posted by Marado at 2012-12-02 13:42:12
PCR验证本就不可靠,为嘛不做酶切,酶切不是一目了然麽……比PCR可靠多了.
空载也有可能扩出条带的,我就被坑过一次,所以之后都不信任PCR验证了.

我做了酶切  酶切跑胶条带合适   不知道能不能继续后续试验
7楼2012-12-03 10:16:52
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查看全部 14 个回答

wangqi20092

新虫 (小有名气)



蛋白之家(金币+1): 谢谢参与
把图片发过来看看,空载体都能出条带,如果引物没污染,那就是你的空载体不是空载体,所以想办法确定是空载体。
2楼2012-12-02 12:19:29
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sarah-miao

银虫 (正式写手)



蛋白之家(金币+1): 谢谢参与
发图给大家看看,可以帮忙解决问题哈

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
3楼2012-12-02 12:57:51
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Marado

金虫 (正式写手)



蛋白之家(金币+1): 谢谢参与
PCR验证本就不可靠,为嘛不做酶切,酶切不是一目了然麽……比PCR可靠多了.
空载也有可能扩出条带的,我就被坑过一次,所以之后都不信任PCR验证了.
4楼2012-12-02 13:42:12
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