应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » pEASY-E1使用中出现的问题
101/1返回列表
查看: 2152  |  回复: 9
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

胡乱走走2011

银虫 (著名写手)

[交流] pEASY-E1使用中出现的问题 已有4人参与

本人用pEASY-E1作为表达载体，先将目的片段和该载体连接，然后转化进Trans-T1感受态细胞中克隆，跳去阳性单克隆菌落进行PCR鉴定，和预期大小一致。然后提取质粒，转化进BLDE23细胞中进行表达，过夜培养后，没有菌落长出来，37.继续过夜，仅有2个克隆，提取鉴定后为假克隆。
请过来人指教下哪里出了问题？是质粒能直接转化BL21(DE3)细胞吗？
谢谢。

[ Last edited by 胡乱走走2011 on 2012-6-7 at 16:59 ]
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
Things change, people grow.
1楼 2012-06-07 16:56:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

kristine2011

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流问题。 2012-06-07 21:01:03
首先成功克隆基因后，除PCR鉴定为阳性克隆，还要测序验证，才能证明你连接是否正确，读码框是否没有问题，有无点突变或移码突变。测序没有任何问题后，再将成功构建的质粒转化表达菌株，进行后续实验。
一般以大肠为宿主菌转化质粒，转化效率应该非常高，过夜没长，就重新转化吧，时间再长长出来的斑一般都不是。
赞一下 回复此楼
2楼2012-06-07 20:19:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

joan198108

铁杆木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
菌液PCR有没有做对照。个人感觉菌落PCR只能初步检测，最好测序验证。本人近期做了不同的两组菌落PCR，每次阴性对照都出现加阳性。
赞一下 回复此楼
3楼2012-06-07 20:33:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

胡乱走走2011

银虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by kristine2011 at 2012-06-07 20:19:25
首先成功克隆基因后，除PCR鉴定为阳性克隆，还要测序验证，才能证明你连接是否正确，读码框是否没有问题，有无点突变或移码突变。测序没有任何问题后，再将成功构建的质粒转化表达菌株，进行后续实验。
一般以大肠 ...

谢谢你哈。
你提到的“读码框是否没有问题，有无点突变或移码突变”，这个如何确定呢？
赞一下 回复此楼
Things change, people grow.
4楼2012-06-07 20:46:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

胡乱走走2011

银虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by joan198108 at 2012-06-07 20:33:26
菌液PCR有没有做对照。个人感觉菌落PCR只能初步检测，最好测序验证。本人近期做了不同的两组菌落PCR，每次阴性对照都出现加阳性。

谢谢哈。
阴性对照就不是不加模板？
赞一下 回复此楼
Things change, people grow.
5楼2012-06-07 20:47:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

kristine2011

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
4楼: Originally posted by 胡乱走走2011 at 2012-06-07 20:46:49
谢谢你哈。
你提到的“读码框是否没有问题，有无点突变或移码突变”，这个如何确定呢？...

从载体上的ATG到你的序列直到最后终止密码子，看看翻译出来是不是你的蛋白啊。点突变，要和你目的基因序列比对啊。不一样的地方那很有可能就突变了。
赞一下 回复此楼
6楼2012-06-08 08:10:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

joan198108

铁杆木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
5楼: Originally posted by 胡乱走走2011 at 2012-06-07 20:47:48
谢谢哈。
阴性对照就不是不加模板？...

模板用等体积的灭菌水替代即可
赞一下 回复此楼
7楼2012-06-08 08:18:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小虫子666

铁杆木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
pEASY-E1 你这个是T-veocter吧？你想做原核表达？ 原核表达的步骤是：克隆目的片段（引物带有原核表达载体所需的酶切位点）转化感受态细胞，然后测序，将测序正确的克隆摇菌提质粒，酶切 与原核表达载体如：pet-32a，连接，转入感受态细胞，提质粒，酶切，测序，将载体正确的质粒再转入BL21，做后期的原核表达分析。
赞一下 回复此楼
8楼2012-06-08 11:20:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jinpeng_6118

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
全式金的这个破载体，我去年也使用过了，测了n个克隆，没一个是正确的
赞一下 回复此楼
人生百态原为海，看破红尘方为岸！
9楼2012-06-08 11:20:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

胡乱走走2011

银虫 (著名写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 小虫子666 at 2012-06-08 11:20:38
pEASY-E1 你这个是T-veocter吧？你想做原核表达？ 原核表达的步骤是：克隆目的片段（引物带有原核表达载体所需的酶切位点）转化感受态细胞，然后测序，将测序正确的克隆摇菌提质粒，酶切 与原核表达载体如：pet-32a ...

pEASY-E1 是表达载体，就是为了省去酶切这步吧，所以就直接用表达载体在克隆细胞中扩增。
赞一下 回复此楼
Things change, people grow.
10楼2012-06-08 22:09:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 胡乱走走2011 的主题更新
101/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] filecode=后面第一个是大写字母 +9 wangze12014 2026-08-14 11/550 2026-08-19 16:30 by wangyue2015
[教师之家] 为什么余额宝的年化利率越来越低？主要原因有哪些？ +4 瞬息宇宙 2026-08-15 4/200 2026-08-19 16:23 by allmydream
[基金申请] 今天基金会出结果吗？20260819 +8 kkkl_v 2026-08-19 8/400 2026-08-19 12:34 by Vivilian
[基金申请] 欢迎发来filecode的Mz6后的代码验证其规律 +52 医学老男孩 2026-08-13 115/5750 2026-08-19 12:09 by 医学老男孩
[基金申请] 2027广东省杰青 +4 奶牛小黑 2026-08-15 10/500 2026-08-19 11:02 by wanfengnew
[基金申请] 朋友圈看到的 +6 wangzilk 2026-08-18 8/400 2026-08-19 10:55 by Haru815
[基金申请] 时间戳变了，能看出什么问题？ +10 基诺咪客 2026-08-17 14/700 2026-08-19 10:34 by 基诺咪客
[基金申请] 咱们一起用铁证分析2026国家社科基金中标与否 +8 启萌科技 2026-08-12 30/1500 2026-08-19 10:22 by 启萌科技
[基金申请] 什么时候开奖？ +6 CrisMessi 2026-08-18 6/300 2026-08-19 08:06 by Equinoxhua
[基金申请] 结合人工智能，周易传统文化，filecode打分制来了，3分以上希望很大。 +4 Tide man 2026-08-12 5/250 2026-08-19 07:41 by 201120518022
[基金申请] 明天放榜？ +5 Shxjjxjkx 2026-08-18 5/250 2026-08-18 18:14 by -大大大大大-
[论文投稿] 投稿咨询 +4 wwm09 2026-08-17 6/300 2026-08-18 15:36 by wwm09
[基金申请] 时间戳又变了8-15 +14 archvillain 2026-08-15 26/1300 2026-08-18 13:37 by phantomgost
[基金申请] 今天维护系统维护 祝所有人 高中 +8 gjjjzhong 2026-08-18 9/450 2026-08-18 13:01 by 家与远方
[基金申请] 93BebMhtakh前后11位开头都是大写 +4 且听虎啸 2026-08-17 5/250 2026-08-18 00:49 by 蔡棒棒菂
[基金申请] 感觉是下周放榜了 +6 angus9576 2026-08-17 11/550 2026-08-17 23:57 by angus9576
[基金申请] 今天系统多次维护，明天很可能放榜！ +8 zju2000 2026-08-16 9/450 2026-08-17 12:20 by lmz0216
[精细化工] 招聘 金属平磨液，抛光液研发工程师 +3 小天0311 2026-08-14 3/150 2026-08-16 07:31 by H9PLUS
[基金申请] 各位道友，我要去昆明玩几天，回来见。 +7 Tide man 2026-08-14 8/400 2026-08-15 01:11 by arzu_hma
[基金申请] Filecode 又变了，巨变 +3 WH3796 2026-08-12 4/200 2026-08-13 14:13 by 小木虫6752397
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭