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胡乱走走2011

银虫 (著名写手)

[交流] pEASY-E1使用中出现的问题 已有4人参与

本人用pEASY-E1作为表达载体,先将目的片段和该载体连接,然后转化进Trans-T1感受态细胞中克隆,跳去阳性单克隆菌落进行PCR鉴定,和预期大小一致。然后提取质粒,转化进BLDE23细胞中进行表达,过夜培养后,没有菌落长出来,37.继续过夜,仅有2个克隆,提取鉴定后为假克隆。
请过来人指教下哪里出了问题?是质粒能直接转化BL21(DE3)细胞吗?
谢谢。

[ Last edited by 胡乱走走2011 on 2012-6-7 at 16:59 ]
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小虫子666

铁杆木虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
pEASY-E1 你这个是T-veocter吧?你想做原核表达? 原核表达的步骤是:克隆目的片段(引物带有原核表达载体所需的酶切位点)转化感受态细胞,然后测序,将测序正确的克隆摇菌提质粒,酶切 与原核表达载体如:pet-32a,连接,转入感受态细胞,提质粒,酶切,测序,将载体正确的质粒再转入BL21,做后期的原核表达分析。
8楼2012-06-08 11:20:38
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kristine2011

金虫 (小有名气)

★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流问题。 2012-06-07 21:01:03
首先成功克隆基因后,除PCR鉴定为阳性克隆,还要测序验证,才能证明你连接是否正确,读码框是否没有问题,有无点突变或移码突变。测序没有任何问题后,再将成功构建的质粒转化表达菌株,进行后续实验。
一般以大肠为宿主菌转化质粒,转化效率应该非常高,过夜没长,就重新转化吧,时间再长长出来的斑一般都不是。
2楼2012-06-07 20:19:25
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
菌液PCR有没有做对照。个人感觉菌落PCR只能初步检测,最好测序验证。本人近期做了不同的两组菌落PCR,每次阴性对照都出现加阳性。
3楼2012-06-07 20:33:26
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胡乱走走2011

银虫 (著名写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by kristine2011 at 2012-06-07 20:19:25
首先成功克隆基因后,除PCR鉴定为阳性克隆,还要测序验证,才能证明你连接是否正确,读码框是否没有问题,有无点突变或移码突变。测序没有任何问题后,再将成功构建的质粒转化表达菌株,进行后续实验。
一般以大肠 ...

谢谢你哈。
你提到的“读码框是否没有问题,有无点突变或移码突变”,这个如何确定呢?
Things change, people grow.
4楼2012-06-07 20:46:49
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