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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » pEASY-E1使用中出现的问题
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胡乱走走2011

银虫 (著名写手)

[交流] pEASY-E1使用中出现的问题 已有4人参与

本人用pEASY-E1作为表达载体，先将目的片段和该载体连接，然后转化进Trans-T1感受态细胞中克隆，跳去阳性单克隆菌落进行PCR鉴定，和预期大小一致。然后提取质粒，转化进BLDE23细胞中进行表达，过夜培养后，没有菌落长出来，37.继续过夜，仅有2个克隆，提取鉴定后为假克隆。
请过来人指教下哪里出了问题？是质粒能直接转化BL21(DE3)细胞吗？
谢谢。

[ Last edited by 胡乱走走2011 on 2012-6-7 at 16:59 ]
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Things change, people grow.
1楼 2012-06-07 16:56:14
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小虫子666

铁杆木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
pEASY-E1 你这个是T-veocter吧？你想做原核表达？ 原核表达的步骤是：克隆目的片段（引物带有原核表达载体所需的酶切位点）转化感受态细胞，然后测序，将测序正确的克隆摇菌提质粒，酶切 与原核表达载体如：pet-32a，连接，转入感受态细胞，提质粒，酶切，测序，将载体正确的质粒再转入BL21，做后期的原核表达分析。
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8楼2012-06-08 11:20:38
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kristine2011

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流问题。 2012-06-07 21:01:03
首先成功克隆基因后，除PCR鉴定为阳性克隆，还要测序验证，才能证明你连接是否正确，读码框是否没有问题，有无点突变或移码突变。测序没有任何问题后，再将成功构建的质粒转化表达菌株，进行后续实验。
一般以大肠为宿主菌转化质粒，转化效率应该非常高，过夜没长，就重新转化吧，时间再长长出来的斑一般都不是。
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2楼2012-06-07 20:19:25
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
菌液PCR有没有做对照。个人感觉菌落PCR只能初步检测，最好测序验证。本人近期做了不同的两组菌落PCR，每次阴性对照都出现加阳性。
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3楼2012-06-07 20:33:26
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胡乱走走2011

银虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by kristine2011 at 2012-06-07 20:19:25
首先成功克隆基因后，除PCR鉴定为阳性克隆，还要测序验证，才能证明你连接是否正确，读码框是否没有问题，有无点突变或移码突变。测序没有任何问题后，再将成功构建的质粒转化表达菌株，进行后续实验。
一般以大肠 ...

谢谢你哈。
你提到的“读码框是否没有问题，有无点突变或移码突变”，这个如何确定呢？
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Things change, people grow.
4楼2012-06-07 20:46:49
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