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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » pEASY-E1使用中出现的问题
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胡乱走走2011

银虫 (著名写手)

[交流] pEASY-E1使用中出现的问题 已有4人参与

本人用pEASY-E1作为表达载体，先将目的片段和该载体连接，然后转化进Trans-T1感受态细胞中克隆，跳去阳性单克隆菌落进行PCR鉴定，和预期大小一致。然后提取质粒，转化进BLDE23细胞中进行表达，过夜培养后，没有菌落长出来，37.继续过夜，仅有2个克隆，提取鉴定后为假克隆。
请过来人指教下哪里出了问题？是质粒能直接转化BL21(DE3)细胞吗？
谢谢。

[ Last edited by 胡乱走走2011 on 2012-6-7 at 16:59 ]
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Things change, people grow.
1楼 2012-06-07 16:56:14
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kristine2011

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
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amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流问题。 2012-06-07 21:01:03
首先成功克隆基因后，除PCR鉴定为阳性克隆，还要测序验证，才能证明你连接是否正确，读码框是否没有问题，有无点突变或移码突变。测序没有任何问题后，再将成功构建的质粒转化表达菌株，进行后续实验。
一般以大肠为宿主菌转化质粒，转化效率应该非常高，过夜没长，就重新转化吧，时间再长长出来的斑一般都不是。
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2楼2012-06-07 20:19:25
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
菌液PCR有没有做对照。个人感觉菌落PCR只能初步检测，最好测序验证。本人近期做了不同的两组菌落PCR，每次阴性对照都出现加阳性。
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3楼2012-06-07 20:33:26
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胡乱走走2011

银虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by kristine2011 at 2012-06-07 20:19:25
首先成功克隆基因后，除PCR鉴定为阳性克隆，还要测序验证，才能证明你连接是否正确，读码框是否没有问题，有无点突变或移码突变。测序没有任何问题后，再将成功构建的质粒转化表达菌株，进行后续实验。
一般以大肠 ...

谢谢你哈。
你提到的“读码框是否没有问题，有无点突变或移码突变”，这个如何确定呢？
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Things change, people grow.
4楼2012-06-07 20:46:49
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胡乱走走2011

银虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by joan198108 at 2012-06-07 20:33:26
菌液PCR有没有做对照。个人感觉菌落PCR只能初步检测，最好测序验证。本人近期做了不同的两组菌落PCR，每次阴性对照都出现加阳性。

谢谢哈。
阴性对照就不是不加模板？
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5楼2012-06-07 20:47:48
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kristine2011

金虫 (小有名气)
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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4楼: Originally posted by 胡乱走走2011 at 2012-06-07 20:46:49
谢谢你哈。
你提到的“读码框是否没有问题，有无点突变或移码突变”，这个如何确定呢？...

从载体上的ATG到你的序列直到最后终止密码子，看看翻译出来是不是你的蛋白啊。点突变，要和你目的基因序列比对啊。不一样的地方那很有可能就突变了。
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6楼2012-06-08 08:10:42
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
5楼: Originally posted by 胡乱走走2011 at 2012-06-07 20:47:48
谢谢哈。
阴性对照就不是不加模板？...

模板用等体积的灭菌水替代即可
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7楼2012-06-08 08:18:06
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小虫子666

铁杆木虫 (正式写手)
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pEASY-E1 你这个是T-veocter吧？你想做原核表达？ 原核表达的步骤是：克隆目的片段（引物带有原核表达载体所需的酶切位点）转化感受态细胞，然后测序，将测序正确的克隆摇菌提质粒，酶切 与原核表达载体如：pet-32a，连接，转入感受态细胞，提质粒，酶切，测序，将载体正确的质粒再转入BL21，做后期的原核表达分析。
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8楼2012-06-08 11:20:38
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jinpeng_6118

木虫 (正式写手)
★
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全式金的这个破载体，我去年也使用过了，测了n个克隆，没一个是正确的
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人生百态原为海，看破红尘方为岸！
9楼2012-06-08 11:20:40
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胡乱走走2011

银虫 (著名写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 小虫子666 at 2012-06-08 11:20:38
pEASY-E1 你这个是T-veocter吧？你想做原核表达？ 原核表达的步骤是：克隆目的片段（引物带有原核表达载体所需的酶切位点）转化感受态细胞，然后测序，将测序正确的克隆摇菌提质粒，酶切 与原核表达载体如：pet-32a ...

pEASY-E1 是表达载体，就是为了省去酶切这步吧，所以就直接用表达载体在克隆细胞中扩增。
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10楼2012-06-08 22:09:21
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