应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » pEASY-E1使用中出现的问题
汕头大学海洋科学接受调剂
51/1返回列表
查看: 1773  |  回复: 9
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

胡乱走走2011

银虫 (著名写手)

[交流] pEASY-E1使用中出现的问题 已有4人参与

本人用pEASY-E1作为表达载体，先将目的片段和该载体连接，然后转化进Trans-T1感受态细胞中克隆，跳去阳性单克隆菌落进行PCR鉴定，和预期大小一致。然后提取质粒，转化进BLDE23细胞中进行表达，过夜培养后，没有菌落长出来，37.继续过夜，仅有2个克隆，提取鉴定后为假克隆。
请过来人指教下哪里出了问题？是质粒能直接转化BL21(DE3)细胞吗？
谢谢。

[ Last edited by 胡乱走走2011 on 2012-6-7 at 16:59 ]
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
Things change, people grow.
1楼 2012-06-07 16:56:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

胡乱走走2011

银虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by kristine2011 at 2012-06-07 20:19:25
首先成功克隆基因后，除PCR鉴定为阳性克隆，还要测序验证，才能证明你连接是否正确，读码框是否没有问题，有无点突变或移码突变。测序没有任何问题后，再将成功构建的质粒转化表达菌株，进行后续实验。
一般以大肠 ...

谢谢你哈。
你提到的“读码框是否没有问题，有无点突变或移码突变”，这个如何确定呢？
赞一下 回复此楼
Things change, people grow.
4楼2012-06-07 20:46:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 10 个回答

kristine2011

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流问题。 2012-06-07 21:01:03
首先成功克隆基因后，除PCR鉴定为阳性克隆，还要测序验证，才能证明你连接是否正确，读码框是否没有问题，有无点突变或移码突变。测序没有任何问题后，再将成功构建的质粒转化表达菌株，进行后续实验。
一般以大肠为宿主菌转化质粒，转化效率应该非常高，过夜没长，就重新转化吧，时间再长长出来的斑一般都不是。
赞一下 回复此楼
2楼2012-06-07 20:19:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

joan198108

铁杆木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
菌液PCR有没有做对照。个人感觉菌落PCR只能初步检测，最好测序验证。本人近期做了不同的两组菌落PCR，每次阴性对照都出现加阳性。
赞一下 回复此楼
3楼2012-06-07 20:33:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

胡乱走走2011

银虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by joan198108 at 2012-06-07 20:33:26
菌液PCR有没有做对照。个人感觉菌落PCR只能初步检测，最好测序验证。本人近期做了不同的两组菌落PCR，每次阴性对照都出现加阳性。

谢谢哈。
阴性对照就不是不加模板？
赞一下 回复此楼
Things change, people grow.
5楼2012-06-07 20:47:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 10 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 22专硕求调剂 +8 haoyun上岸 2026-04-11 10/500 2026-04-13 22:15 by zhq0425
[考研] 生物学308分求调剂（一志愿华东师大）做过分子实验 +9 相信必会光芒万� 2026-04-07 10/500 2026-04-13 10:20 by 可淡不可忘
[考研] 2本，初试303，0860求调剂 +6 floriea 2026-04-12 8/400 2026-04-12 18:13 by zhouxiaoyu
[考研] 299求调剂 +8 ZVVZ13 2026-04-08 8/400 2026-04-12 00:40 by 蓝云思雨
[考研] 22408调剂315分 +3 zhuangyan123 2026-04-09 3/150 2026-04-12 00:25 by 蓝云思雨
[考研] 求调剂 +11 月@163.com 2026-04-07 13/650 2026-04-11 22:55 by BruceLiu320
[考研] 359求调剂 +5 胃痉挛累了 2026-04-11 5/250 2026-04-11 19:55 by lbsjt
[考研] 298求调剂 +5 残荷新柳 2026-04-07 5/250 2026-04-11 11:02 by 紫曦紫棋
[考研] 298求调剂 +9 钉叮咚冬瓜 2026-04-07 11/550 2026-04-11 09:35 by zhq0425
[考研] 0854调剂 +4 长弓傲 2026-04-09 4/200 2026-04-11 09:18 by 猪会飞
[考研] 368求调剂 +3 17385968172 2026-04-10 3/150 2026-04-10 20:12 by 电子奥德彪
[考研] 计算机类求调剂，22408-274分 +7 上岸de小虫 2026-04-09 8/400 2026-04-10 19:56 by fxue1114
[论文投稿] mdpi小修rvr时间四五天了 20+3 哈哈high 2026-04-08 5/250 2026-04-10 16:02 by 北京莱茵润色
[考研] 085601初试330分找调剂 +10 流心奶黄包l 2026-04-09 10/500 2026-04-10 08:14 by Sammy2
[考研] 348求调剂 +3 candyyyi 2026-04-09 3/150 2026-04-09 17:20 by 段伟艳
[考研] 招收有机化学、化工，药学，食品灯专业学生 +3 yrfhjgdj 2026-04-08 3/150 2026-04-09 10:15 by QYQX_123
[考研] 328求调剂 +17 lftmya 2026-04-07 18/900 2026-04-09 08:05 by 5268321
[考研] 电子信息346 +4 zuoshaodian 2026-04-08 4/200 2026-04-08 11:54 by zzucheup
[考研] 331求调剂 +5 张元一 2026-04-07 6/300 2026-04-07 22:13 by hemengdong
[考研] 307求调剂 +3 Youth@@ 2026-04-07 3/150 2026-04-07 09:25 by 小黑不怕难
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭