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胡乱走走2011

银虫 (著名写手)

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[交流] pEASY-E1使用中出现的问题已有4人参与

本人用pEASY-E1作为表达载体，先将目的片段和该载体连接，然后转化进Trans-T1感受态细胞中克隆，跳去阳性单克隆菌落进行PCR鉴定，和预期大小一致。然后提取质粒，转化进BLDE23细胞中进行表达，过夜培养后，没有菌落长出来，37.继续过夜，仅有2个克隆，提取鉴定后为假克隆。
请过来人指教下哪里出了问题？是质粒能直接转化BL21(DE3)细胞吗？
谢谢。

[ Last edited by 胡乱走走2011 on 2012-6-7 at 16:59 ]

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Things change, people grow.

1楼 2012-06-07 16:56:14

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胡乱走走2011

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引用回帖:

2楼: Originally posted by kristine2011 at 2012-06-07 20:19:25
首先成功克隆基因后，除PCR鉴定为阳性克隆，还要测序验证，才能证明你连接是否正确，读码框是否没有问题，有无点突变或移码突变。测序没有任何问题后，再将成功构建的质粒转化表达菌株，进行后续实验。
一般以大肠 ...