应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » pEASY-E1使用中出现的问题
101/1返回列表
查看: 1707  |  回复: 9
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

胡乱走走2011

银虫 (著名写手)

[交流] pEASY-E1使用中出现的问题 已有4人参与

本人用pEASY-E1作为表达载体，先将目的片段和该载体连接，然后转化进Trans-T1感受态细胞中克隆，跳去阳性单克隆菌落进行PCR鉴定，和预期大小一致。然后提取质粒，转化进BLDE23细胞中进行表达，过夜培养后，没有菌落长出来，37.继续过夜，仅有2个克隆，提取鉴定后为假克隆。
请过来人指教下哪里出了问题？是质粒能直接转化BL21(DE3)细胞吗？
谢谢。

[ Last edited by 胡乱走走2011 on 2012-6-7 at 16:59 ]
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
Things change, people grow.
1楼 2012-06-07 16:56:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

kristine2011

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流问题。 2012-06-07 21:01:03
首先成功克隆基因后，除PCR鉴定为阳性克隆，还要测序验证，才能证明你连接是否正确，读码框是否没有问题，有无点突变或移码突变。测序没有任何问题后，再将成功构建的质粒转化表达菌株，进行后续实验。
一般以大肠为宿主菌转化质粒，转化效率应该非常高，过夜没长，就重新转化吧，时间再长长出来的斑一般都不是。
赞一下 回复此楼
2楼2012-06-07 20:19:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

joan198108

铁杆木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
菌液PCR有没有做对照。个人感觉菌落PCR只能初步检测，最好测序验证。本人近期做了不同的两组菌落PCR，每次阴性对照都出现加阳性。
赞一下 回复此楼
3楼2012-06-07 20:33:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

胡乱走走2011

银虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by kristine2011 at 2012-06-07 20:19:25
首先成功克隆基因后，除PCR鉴定为阳性克隆，还要测序验证，才能证明你连接是否正确，读码框是否没有问题，有无点突变或移码突变。测序没有任何问题后，再将成功构建的质粒转化表达菌株，进行后续实验。
一般以大肠 ...

谢谢你哈。
你提到的“读码框是否没有问题，有无点突变或移码突变”，这个如何确定呢？
赞一下 回复此楼
Things change, people grow.
4楼2012-06-07 20:46:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

胡乱走走2011

银虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by joan198108 at 2012-06-07 20:33:26
菌液PCR有没有做对照。个人感觉菌落PCR只能初步检测，最好测序验证。本人近期做了不同的两组菌落PCR，每次阴性对照都出现加阳性。

谢谢哈。
阴性对照就不是不加模板？
赞一下 回复此楼
Things change, people grow.
5楼2012-06-07 20:47:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

kristine2011

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
4楼: Originally posted by 胡乱走走2011 at 2012-06-07 20:46:49
谢谢你哈。
你提到的“读码框是否没有问题，有无点突变或移码突变”，这个如何确定呢？...

从载体上的ATG到你的序列直到最后终止密码子，看看翻译出来是不是你的蛋白啊。点突变，要和你目的基因序列比对啊。不一样的地方那很有可能就突变了。
赞一下 回复此楼
6楼2012-06-08 08:10:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

joan198108

铁杆木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
5楼: Originally posted by 胡乱走走2011 at 2012-06-07 20:47:48
谢谢哈。
阴性对照就不是不加模板？...

模板用等体积的灭菌水替代即可
赞一下 回复此楼
7楼2012-06-08 08:18:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小虫子666

铁杆木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
pEASY-E1 你这个是T-veocter吧？你想做原核表达？ 原核表达的步骤是：克隆目的片段（引物带有原核表达载体所需的酶切位点）转化感受态细胞，然后测序，将测序正确的克隆摇菌提质粒，酶切 与原核表达载体如：pet-32a，连接，转入感受态细胞，提质粒，酶切，测序，将载体正确的质粒再转入BL21，做后期的原核表达分析。
赞一下 回复此楼
8楼2012-06-08 11:20:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jinpeng_6118

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
全式金的这个破载体，我去年也使用过了，测了n个克隆，没一个是正确的
赞一下 回复此楼
人生百态原为海，看破红尘方为岸！
9楼2012-06-08 11:20:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

胡乱走走2011

银虫 (著名写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 小虫子666 at 2012-06-08 11:20:38
pEASY-E1 你这个是T-veocter吧？你想做原核表达？ 原核表达的步骤是：克隆目的片段（引物带有原核表达载体所需的酶切位点）转化感受态细胞，然后测序，将测序正确的克隆摇菌提质粒，酶切 与原核表达载体如：pet-32a ...

pEASY-E1 是表达载体，就是为了省去酶切这步吧，所以就直接用表达载体在克隆细胞中扩增。
赞一下 回复此楼
Things change, people grow.
10楼2012-06-08 22:09:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 胡乱走走2011 的主题更新
101/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 一志愿中南大学理学化学 +3 15779376950 2026-03-01 3/150 2026-03-01 13:47 by ALZOOZL
[考研] 材料284求调剂，一志愿郑州大学英一数二专硕 +9 想上岸的土拨鼠 2026-02-28 9/450 2026-03-01 13:36 by 那个人样子好怪�
[考研] 290求调剂 +8 材料专硕调剂； 2026-02-28 9/450 2026-03-01 12:46 by 闭眼看蓝天
[考研] 0856化工专硕求调剂 +6 董boxing 2026-03-01 6/300 2026-03-01 12:45 by houyaoxu
[考研] 0856材料专业298分有科研经历 硕士研究生调剂自荐信 +6 zyf上岸 2026-03-01 6/300 2026-03-01 12:43 by liqiongjy
[考研] 求调剂 +5 repeatt?t 2026-02-28 5/250 2026-03-01 11:43 by 王伟要上岸啊
[考研] 317一志愿华南理工电气工程求调剂 +6 Soliloquy_Q 2026-02-28 11/550 2026-03-01 11:14 by 歌liekkas
[考研] 寻找调剂 +4 LYidhsjabdj 2026-02-28 4/200 2026-03-01 10:56 by sunny81
[考博] 博士自荐 +4 kkluvs 2026-02-28 4/200 2026-03-01 10:19 by 馥安馥安
[考研] 0856求调剂285 +6 吕仔龙 2026-02-28 6/300 2026-03-01 10:03 by wang_dand
[论文投稿] 求助coordination chemistry reviews 的写作模板 10+3 ljplijiapeng 2026-02-27 4/200 2026-03-01 09:07 by babero
[论文投稿] Optics letters投稿被拒求助 30+3 luckyry 2026-02-26 4/200 2026-03-01 09:06 by babero
[考研] 285求调剂 +6 满头大汗的学生 2026-02-28 6/300 2026-03-01 06:29 by Trying]
[考研] 化工专硕348，一志愿985求调剂 +4 弗格个 2026-02-28 6/300 2026-02-28 22:00 by wang_dand
[考研] 085600材料工程一志愿中科大总分312求调剂 +8 吃宵夜1 2026-02-28 10/500 2026-02-28 20:27 by L135790
[考研] 298求调剂 +8 人间唯你是清欢 2026-02-28 11/550 2026-02-28 20:26 by L135790
[考研] 276求调剂 +3 路lyh123 2026-02-28 4/200 2026-02-28 19:45 by 路lyh123
[高分子] 求环氧树脂研发1名 +3 孙xc 2026-02-25 11/550 2026-02-28 16:57 by ichall
[考研] 265分求调剂不调专业和学校有行学上就 +4 礼堂丁真258 2026-02-28 6/300 2026-02-28 16:18 by 求调剂zz
[考研] 0856调剂 +3 刘梦微 2026-02-28 3/150 2026-02-28 13:22 by houyaoxu
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭