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蛋白之家

新虫 (小有名气)

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[交流] 连接表达载体后的检测问题

最近一直在做酶切，连接，以及检测
但是发现一些问题，想咨询大家，最近结果如下：
1. 酶切后连接，这部分做的比较稳定，长斑情况虽不是特别多，只有那么几个
2.将长好的斑摇菌后，提质粒，质粒PCR，都有合适的条带
3.不加模板，PCR的结果很郁闷，一共4个基因，1号基因扩出来了，2,3,4，没有
4.将空载体作为模板，PCR的结果：1,2,3,4都有条带，但2的条带比目的条带偏小，3比目的条带偏大，1和4的条带看着和目的条带大小一样。

现在的问题是：不明白为什么空载体能扩出来东西？如果说我的引物污染了，那不加模板也应该是能扩出来东西的；用的是生工买的PCR mix
现在这些结果真是让人郁闷，希望大家帮忙分析一下这个情况该如何
是不是得重新开始？
谢谢

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1楼2012-12-02 11:49:53

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amilie030312

金虫 (正式写手)

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★ ★ ★ ★
蛋白之家(金币+1): 谢谢参与
小丹木木: 金币+3, 鼓励交流 2012-12-03 16:43:21

上面说的很有道理，应该酶切，PCR检测的结果不一定可靠，有污染、有杂带、有····的都能扩出假阳性出来，所以酶切的结果更加可信。
你怎么样判断空载呢，如果前面双切的质粒空载的可能性很小，可能就不是空载。
如果可以就测个序吧，另外，如果还要做下游实验建议不要乱用PCR酶，要用保真度较高的酶，不然容易出现错配。