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蛋白之家

新虫 (小有名气)

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[交流] 连接表达载体后的检测问题

最近一直在做酶切，连接，以及检测
但是发现一些问题，想咨询大家，最近结果如下：
1. 酶切后连接，这部分做的比较稳定，长斑情况虽不是特别多，只有那么几个
2.将长好的斑摇菌后，提质粒，质粒PCR，都有合适的条带
3.不加模板，PCR的结果很郁闷，一共4个基因，1号基因扩出来了，2,3,4，没有
4.将空载体作为模板，PCR的结果：1,2,3,4都有条带，但2的条带比目的条带偏小，3比目的条带偏大，1和4的条带看着和目的条带大小一样。

现在的问题是：不明白为什么空载体能扩出来东西？如果说我的引物污染了，那不加模板也应该是能扩出来东西的；用的是生工买的PCR mix
现在这些结果真是让人郁闷，希望大家帮忙分析一下这个情况该如何
是不是得重新开始？
谢谢

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1楼 2012-12-02 11:49:53

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引用回帖:

11楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-04 07:44:08
20ng/ul是不高，如果你用的是表达载体的话是有可能的。一般表达载体的质粒拷贝数不是很高，一般多收些菌裂解才能勉强达到提克隆载体质粒的的浓度。此外，你用的什么受体菌？一般做表达是先把克隆转化到克隆菌株后测 ...

载体：pET28a 感受态： BL21(DE3)
我昨天也想到了这个裂解的问题最近不是天凉了么 SDS出现白色沉淀了，今天将其加热溶解后再重新提质粒然后看效果