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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 存档旧帖 » 连接表达载体后的检测问题
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蛋白之家

新虫 (小有名气)

[交流] 连接表达载体后的检测问题

最近一直在做酶切，连接，以及检测
但是发现一些问题，想咨询大家，最近结果如下：
1. 酶切后连接，这部分做的比较稳定，长斑情况虽不是特别多，只有那么几个
2.将长好的斑摇菌后，提质粒，质粒PCR，都有合适的条带
3.不加模板，PCR的结果很郁闷，一共4个基因，1号基因扩出来了，2,3,4，没有
4.将空载体作为模板，PCR的结果：1,2,3,4都有条带，但2的条带比目的条带偏小，3比目的条带偏大，1和4的条带看着和目的条带大小一样。

现在的问题是：不明白为什么空载体能扩出来东西？如果说我的引物污染了，那不加模板也应该是能扩出来东西的；用的是生工买的PCR mix  
现在这些结果真是让人郁闷，希望大家帮忙分析一下这个情况该如何
是不是得重新开始？
谢谢
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1楼 2012-12-02 11:49:53
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蛋白之家

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-03 12:15:16
需不需要测序要看你克隆的目的。比方说你想做表达的话是需要测序的。一般是先酶切鉴定正确后测序。...

今天将另外两个没有切好的重新提了质粒，结果质粒浓度太低了，才20ng/ul 结果没切不出来东西   
我想做个表达，但以前测表达载体的序列 总是测不出来啊   不知道为什么
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9楼2012-12-03 14:21:40
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wangqi20092

新虫 (小有名气)
★
蛋白之家(金币+1): 谢谢参与
把图片发过来看看，空载体都能出条带，如果引物没污染，那就是你的空载体不是空载体，所以想办法确定是空载体。
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2楼2012-12-02 12:19:29
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sarah-miao

银虫 (正式写手)
★
蛋白之家(金币+1): 谢谢参与
发图给大家看看，可以帮忙解决问题哈

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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3楼2012-12-02 12:57:51
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Marado

金虫 (正式写手)
★
蛋白之家(金币+1): 谢谢参与
PCR验证本就不可靠，为嘛不做酶切，酶切不是一目了然麽……比PCR可靠多了.
空载也有可能扩出条带的，我就被坑过一次，所以之后都不信任PCR验证了.
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4楼2012-12-02 13:42:12
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