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cxb-abc

银虫 (小有名气)

[交流] 挑单克隆后，菌液PCR检测所有条带都偏小，目的条带没有出现 已有7人参与

各位高手大家好，我最近做转化，Page胶回收片段在400bp左右，挑单克隆后PCR菌液目的条带没有出现，但在２５０ｂｐ左右出现一条带，不知何故？以下是我做的7个样，每个样挑3个单菌克隆，ＰＣＲ产物图片如下：

2012-9-22-11-08-37.jpg
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1楼 2012-09-27 21:42:48
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无疆@行者

银虫 (小有名气)
★
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LZ可以拿出一两个，提取质粒，做一下酶切鉴定，如果酶切正常那么说明是对的，酶切不正常那肯定不对，不过一般来说PCR条带不对，阳性克隆的可能性很小
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2楼2012-09-27 23:47:32
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Frank王

铜虫 (初入文坛)
★
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可能没连接上，最好挑几个测序看看。
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3楼2012-09-28 09:53:32
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cxb-abc

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 无疆@行者 at 2012-09-27 23:47:32
LZ可以拿出一两个，提取质粒，做一下酶切鉴定，如果酶切正常那么说明是对的，酶切不正常那肯定不对，不过一般来说PCR条带不对，阳性克隆的可能性很小

谢谢，我得PAGE胶放了有2个月了，老师说可能胶板上的微生物作用是原始DNA差异片段降解了，目前还没有跑出新版，待解决中
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4楼2012-09-28 11:21:58
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chenguestc

木虫 (职业作家)
★ ★ ★
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小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-09-28 14:47:07
个人觉得，你老板说的可能性很小。
建议从切胶重新做。
1，切胶回收后请取几微升跑胶确定分子量是对的
2，分子量对再连接转化再涂平板
3，菌落PCR检测，用你的特异引物和通用引物一起来检测
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5楼2012-09-28 12:20:43
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ahsy

铜虫 (初入文坛)
★
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你老板说的不对，有可能没连接上，应该用你连接片段的引物进行PCR扩增验证一下。
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6楼2012-09-28 15:03:15
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小城大宝

新虫 (初入文坛)
★
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应该是没连上的问题，跑出来的是载体。
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用你的笑容去改变这个世界，别让这个世界改变了你的笑容。
7楼2012-09-28 18:12:43
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lidonghong

金虫 (正式写手)
★
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可能是没连接上或者切胶的问题 提取质粒做个质粒酶切和质粒PCR吧 然后再分析
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生物化学与分子生物学
8楼2012-09-29 16:08:39
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cxb-abc

银虫 (小有名气)
page 胶新板跑出来后，回收，经PCR扩增后，原本350bp 左右的片段在1%琼脂糖胶上还是250 bp 以下，我该怎么办？
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9楼2012-10-10 09:47:02
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crystalfrog

铜虫 (小有名气)
★
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我的建议是你不要做菌落pcr了 ，挑三个菌摇一下，如果没有切出来就直接放弃，重新连接
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10楼2013-03-21 22:57:01
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