[求助] 酶切问题求助

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1楼2012-09-04 14:23:21

回帖置顶 ( 共有1个 )

huguangdong

至尊木虫 (职业作家)

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【答案】应助回帖

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小丹木木: 金币+5, MolEPI+1, 赞同哦 2012-09-05 14:01:39
M110935: 金币+2, ★★★★★最佳答案 2012-09-05 14:11:27

额，看了上面的回答有点无语，楼主注意一下一下几点：
1 首先检查感受态质量，建议做一个对照试验，找个以前能转化出来的质粒作对照。
2 质粒转化只需要加1微升足以，至于步骤严格按照传统方法进行，另外需要说明的是，PET系列载体是原核表达载体，拷贝数比一般质粒要低很多，转化前最好测一下质粒浓度，保证有50ng转化就行了。
3 还是拷贝数的问题，由于PET载体的特殊性，提取质粒收菌要非常多，一般小提收菌要在6毫升以上，而且菌液还要浓一些，就这样，提取的质粒浓度都不是非常大，所以也有可能是收菌太少导致质粒浓度过低看不出条带。
4 转化过程本身一般不会有问题，容易有问题的就是感受态和抗生素，还是建议做对照来排除这两个因素。

11楼2012-09-05 11:24:13

普通回帖

windsor2011

银虫 (小有名气)

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【答案】应助回帖

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M110935: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-09-04 19:13:02
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-09-05 14:00:24

转化之前的PET-32a质粒酶切切出了大小正确的条带,那只是说明你的质粒没问题，但不能说明你的体系没问题。而你转化之后酶切却没条带，这说明你或许没有转化进去，如果确定转化进去了，那你就要真的考虑你的酶切体系是否正确，如果体系合理，那酶切结果会理想的。祝好运。

只要功夫深铁杵磨成针

2楼2012-09-04 15:23:24

dshlove

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【答案】应助回帖

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M110935: 金币+1 2012-09-05 08:15:14

你可以先做一下通用引物的质粒PCR，用没有连接的质粒做对照。
如果，可以做出来。那么把你质粒浓度提高酶切，点样时候多点些。有时候不是没切开，是你压根看不到。

3楼2012-09-04 15:50:55

M110935

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引用回帖:

2楼: Originally posted by windsor2011 at 2012-09-04 15:23:24
转化之前的PET-32a质粒酶切切出了大小正确的条带,那只是说明你的质粒没问题，但不能说明你的体系没问题。而你转化之后酶切却没条带，这说明你或许没有转化进去，如果确定转化进去了，那你就要真的考虑你的酶切体系是 ...

嗯，下午我也考虑到可能压根没有转进去，所以晚上在重新转化，希望成功

4楼2012-09-04 19:12:53