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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 酶切问题求助
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本帖产生 1 个 MolEPI ，点击这里进行查看

M110935

金虫 (小有名气)

[求助] 酶切问题求助

最近将PET-32a转化BL21，转进去后挑了5个单菌落，然后小提质粒酶切鉴定。但是酶切的结果是切不出任何的条带，并且转化之前的PET-32a质粒酶切切出了大小正确的条带。这说明我的体系是没有问题的，那为什么挑取的这5个菌落，小提质粒酶切却切不出来东西呢？大家帮忙分析下，谢谢
P.S  我用的是天根的质粒小提试剂盒
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1楼 2012-09-04 14:23:21
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回帖置顶 ( 共有1个 )

huguangdong

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+5, MolEPI+1, 赞同哦 2012-09-05 14:01:39
M110935: 金币+2, ★★★★★最佳答案 2012-09-05 14:11:27
额，看了上面的回答有点无语，楼主注意一下一下几点：
1 首先检查感受态质量，建议做一个对照试验，找个以前能转化出来的质粒作对照。
2 质粒转化只需要加1微升足以，至于步骤严格按照传统方法进行，另外需要说明的是，PET系列载体是原核表达载体，拷贝数比一般质粒要低很多，转化前最好测一下质粒浓度，保证有50ng转化就行了。
3 还是拷贝数的问题，由于PET载体的特殊性，提取质粒收菌要非常多，一般小提收菌要在6毫升以上，而且菌液还要浓一些，就这样，提取的质粒浓度都不是非常大，所以也有可能是收菌太少导致质粒浓度过低看不出条带。
4 转化过程本身一般不会有问题，容易有问题的就是感受态和抗生素，还是建议做对照来排除这两个因素。
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11楼2012-09-05 11:24:13
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普通回帖

windsor2011

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
M110935: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-09-04 19:13:02
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-09-05 14:00:24
转化之前的PET-32a质粒酶切切出了大小正确的条带,那只是说明你的质粒没问题，但不能说明你的体系没问题。而你转化之后酶切却没条带，这说明你或许没有转化进去，如果确定转化进去了，那你就要真的考虑你的酶切体系是否正确，如果体系合理，那酶切结果会理想的。祝好运。
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只要功夫深铁杵磨成针
2楼2012-09-04 15:23:24
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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
M110935: 金币+1 2012-09-05 08:15:14
你可以先做一下通用引物的质粒PCR，用没有连接的质粒做对照。
如果，可以做出来。那么把你质粒浓度提高酶切，点样时候多点些。有时候不是没切开，是你压根看不到。
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3楼2012-09-04 15:50:55
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M110935

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by windsor2011 at 2012-09-04 15:23:24
转化之前的PET-32a质粒酶切切出了大小正确的条带,那只是说明你的质粒没问题，但不能说明你的体系没问题。而你转化之后酶切却没条带，这说明你或许没有转化进去，如果确定转化进去了，那你就要真的考虑你的酶切体系是 ...

嗯，下午我也考虑到可能压根没有转进去，所以晚上在重新转化，希望成功
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4楼2012-09-04 19:12:53
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M110935

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by dshlove at 2012-09-04 15:50:55
你可以先做一下通用引物的质粒PCR，用没有连接的质粒做对照。
如果，可以做出来。那么把你质粒浓度提高酶切，点样时候多点些。有时候不是没切开，是你压根看不到。

关键最近这个PCR老是出问题，阴性的也能扩出目的条带。但是酶切却什么也没有，
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5楼2012-09-04 19:15:13
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和平信

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
M110935: 金币+1 2012-09-05 08:15:00
挑菌后检测步骤：1、质粒pcr
2、小提质粒，跑胶，看是否提出来了
3、按照酶切体系进行酶切。
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6楼2012-09-04 19:43:39
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137167741

至尊木虫 (著名写手)
是不是试剂盒的问题
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总有一天我要修改用户名。
7楼2012-09-04 20:04:43
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M110935

金虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 137167741 at 2012-09-04 20:04:43
是不是试剂盒的问题

我也怀疑试剂盒有问题，每次提出来浓度都很低，是天根的
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8楼2012-09-05 08:15:46
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137167741

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可以尝试一下换TAKARA的
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总有一天我要修改用户名。
9楼2012-09-05 08:40:23
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gwd0312

木虫 (正式写手)

“无冕之王”

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
8楼: Originally posted by M110935 at 2012-09-05 08:15:46
我也怀疑试剂盒有问题，每次提出来浓度都很低，是天根的...

试剂盒提取的质粒纯度很高，但是量比较少。你提质粒是可以把菌液的量加大，其他的试剂相应增加。
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持之以恒、永不放弃！
10楼2012-09-05 10:41:15
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