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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助各位大神关于含组氨酸标签蛋白纯化的问题
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roy5513

新虫 (初入文坛)

[求助] 求助各位大神关于含组氨酸标签蛋白纯化的问题

各位大神，我的蛋白加上组氨酸标签后理论大小约8.5KDa，经Ni亲和层析纯化后进行透析浓缩，之后跑蛋白电泳发现大小小于6KDa，这是怎么回事啊？两个蛋白都是这样。在进行蛋白水平之前工程菌的质粒都经过测序验证，插入片段的序列都正确。求大神指教啊！！！！！！！
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1楼2012-08-22 08:32:20
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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
因为电泳是定性的分析，再者到小分子量时候，电泳会不准的。
最好的方法是质谱检测下。
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2楼2012-08-22 08:51:05
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王礼鹏

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-08-22 15:19:02
首先确定是蛋白没有挂上柱子都流穿了，还是蛋白没有被洗脱下来。原因可能有很多，比如组氨酸标签没有完全暴露或者丢失，或超声的功率太大，蛋白炭化，没有释放出来。可以在变性条件下用4M-6M盐酸胍进行纯化；若是洗脱有问题可以增加咪唑的梯度洗脱或加非离子去污剂（2%TritonX-100）至缓冲液中防止非特异性疏水作用。。。。。得自己慢慢摸索呀，祝实验顺利！能把图片发上来看看吗？
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3楼2012-08-22 09:06:47
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gelois

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-08-22 15:19:10
想问下，你是跑的SDS-PAGE么？对于分子量小于15KD的，一般都介意跑tricine sds page，用小MARKER，虽然过程比较麻烦，但是看得稍微准确一点。
其次，跑胶看大小，其实也只能当做是一种大致的辨认手段，很多时候蛋白都会出现偏大或者偏小的情况，想要比较精确的知道，有条件的话，就最好去打个MS确认一下。
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roy5513
4楼2012-08-22 10:17:34
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roy5513

新虫 (初入文坛)
送鲜花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by gelois at 2012-08-22 10:17:34
想问下，你是跑的SDS-PAGE么？对于分子量小于15KD的，一般都介意跑tricine sds page，用小MARKER，虽然过程比较麻烦，但是看得稍微准确一点。
其次，跑胶看大小，其实也只能当做是一种大致的辨认手段，很多时候蛋白 ...

是SDS-PAGE  没办法 只能去做质谱了  还有请教一下 是不是分子量小的蛋白在跑SDS-PAGE的时候容易发生弥散？
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5楼2012-08-22 14:32:36
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roy5513

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 王礼鹏 at 2012-08-22 09:06:47
首先确定是蛋白没有挂上柱子都流穿了，还是蛋白没有被洗脱下来。原因可能有很多，比如组氨酸标签没有完全暴露或者丢失，或超声的功率太大，蛋白炭化，没有释放出来。可以在变性条件下用4M-6M盐酸胍进行纯化；若是洗 ...

之前选择这个浓度的咪唑洗脱都没有问题，谢谢 看来最好的方法还是先去做个质谱分析看看了
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6楼2012-08-22 14:36:44
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gelois

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-08-22 15:19:23
roy5513: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-08-23 08:04:10
引用回帖:
5楼: Originally posted by roy5513 at 2012-08-22 14:32:36
是SDS-PAGE  没办法 只能去做质谱了  还有请教一下 是不是分子量小的蛋白在跑SDS-PAGE的时候容易发生弥散？...

看你的胶照片，和蛋白本身的分子量大小没有关系，是你配胶没有配好，因为你的MARKER也挺弥散的，应该是下层胶没有压好。
不过因为你是跑SDS-PAGE的关系，所以你的目的蛋白很下，一般的胶跑那么小的蛋白都会有一点点弥散。
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7楼2012-08-22 14:59:31
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王礼鹏

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
roy5513: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-08-23 08:04:22
从你的图片看，我觉得是你跑胶有点问题，蛋白本身应该没多大关系，可以做下WB或质谱实验验证一下。。。。。。祝实验顺利
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8楼2012-08-22 19:32:08
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rfengyi

禁虫 (正式写手)
本帖内容被屏蔽
9楼2012-08-24 08:58:03
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