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roy5513

新虫 (初入文坛)

[求助] 求助各位大神关于含组氨酸标签蛋白纯化的问题

各位大神,我的蛋白加上组氨酸标签后理论大小约8.5KDa,经Ni亲和层析纯化后进行透析浓缩,之后跑蛋白电泳发现大小小于6KDa,这是怎么回事啊?两个蛋白都是这样。在进行蛋白水平之前工程菌的质粒都经过测序验证,插入片段的序列都正确。求大神指教啊!!!!!!!
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roy5513

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 王礼鹏 at 2012-08-22 09:06:47
首先确定是蛋白没有挂上柱子都流穿了,还是蛋白没有被洗脱下来。原因可能有很多,比如组氨酸标签没有完全暴露或者丢失,或超声的功率太大,蛋白炭化,没有释放出来。可以在变性条件下用4M-6M盐酸胍进行纯化;若是洗 ...

之前选择这个浓度的咪唑洗脱都没有问题,谢谢 看来最好的方法还是先去做个质谱分析看看了


6楼2012-08-22 14:36:44
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查看全部 9 个回答

dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
因为电泳是定性的分析,再者到小分子量时候,电泳会不准的。
最好的方法是质谱检测下。
2楼2012-08-22 08:51:05
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王礼鹏

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-08-22 15:19:02
首先确定是蛋白没有挂上柱子都流穿了,还是蛋白没有被洗脱下来。原因可能有很多,比如组氨酸标签没有完全暴露或者丢失,或超声的功率太大,蛋白炭化,没有释放出来。可以在变性条件下用4M-6M盐酸胍进行纯化;若是洗脱有问题可以增加咪唑的梯度洗脱或加非离子去污剂(2%TritonX-100)至缓冲液中防止非特异性疏水作用。。。。。得自己慢慢摸索呀,祝实验顺利!能把图片发上来看看吗?
3楼2012-08-22 09:06:47
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gelois

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-08-22 15:19:10
想问下,你是跑的SDS-PAGE么?对于分子量小于15KD的,一般都介意跑tricine sds page,用小MARKER,虽然过程比较麻烦,但是看得稍微准确一点。
其次,跑胶看大小,其实也只能当做是一种大致的辨认手段,很多时候蛋白都会出现偏大或者偏小的情况,想要比较精确的知道,有条件的话,就最好去打个MS确认一下。

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4楼2012-08-22 10:17:34
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