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新虫 (小有名气)

[求助] 使用E.coli复制质粒,提取质粒产量很低

问题如题,使用invitrogen的TOP 10 Chemically Competent cell作为宿主菌复制PCR2.1 载体携带基因的质粒。culture体积是10ml, 挑单菌落接种,抗性是Gentamicin,我是在菌液OD达到1.5之后才提取质粒的。质粒提取用的是qiagen的试剂盒,最后使用50ulEB洗脱,但是质粒浓度很低。这是为什么了?
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 西瓜斑斑又出现了哈,围观 2012-07-11 13:40:57
OD不是太大问题,一般质粒随便摇都可以的。过夜的我提过,摇6个小时、10个小时的也做过,都ok。
个人认为你的问题是culture用太多了,导致加溶液2时裂解不充分,所以质粒得率低。一般用1.5mL EP管离心收集1~3次就可以了,具体看菌体有多少。10mL绝对是太多啦。
8楼2012-07-10 19:22:18
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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
首先你的OD略低,而且不知道你提质粒用了多少的菌液?一般是3-5ml,还是在菌液浓度很好的情况下。
2楼2012-07-09 09:00:52
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Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
可以减少洗脱体积,我一般3ml菌液最后用35ul的洗脱体积
Look,ifyouhadoneshot,oroneopportunity,toseizeeverythingyoueverwanted,inonemoment.Wouldyoucaptureit,orjustletitslip?
3楼2012-07-09 09:46:40
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by dshlove at 2012-07-09 09:00:52
首先你的OD略低,而且不知道你提质粒用了多少的菌液?一般是3-5ml,还是在菌液浓度很好的情况下。

是 有点低了,一般提取质粒,是将菌液过夜培养后再提取,OD应该在10以上了吧?
过夜菌液4ml,肯定没问题。
生物资源交流QQ群:1044518333
4楼2012-07-09 10:10:17
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