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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 使用E.coli复制质粒，提取质粒产量很低
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593318518

新虫 (小有名气)

[求助] 使用E.coli复制质粒，提取质粒产量很低

问题如题，使用invitrogen的TOP 10 Chemically Competent cell作为宿主菌复制PCR2.1 载体携带基因的质粒。culture体积是10ml， 挑单菌落接种，抗性是Gentamicin，我是在菌液OD达到1.5之后才提取质粒的。质粒提取用的是qiagen的试剂盒，最后使用50ulEB洗脱，但是质粒浓度很低。这是为什么了？
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1楼 2012-07-08 21:59:32
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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小丹木木: 金币+3, 西瓜斑斑又出现了哈，围观 2012-07-11 13:40:57
OD不是太大问题，一般质粒随便摇都可以的。过夜的我提过，摇6个小时、10个小时的也做过，都ok。
个人认为你的问题是culture用太多了，导致加溶液2时裂解不充分，所以质粒得率低。一般用1.5mL EP管离心收集1~3次就可以了，具体看菌体有多少。10mL绝对是太多啦。
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8楼2012-07-10 19:22:18
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

不知道你摇了多久，时间过长的话抗生素抗性都没了，杂菌长起来，这样虽然菌体多，但实际含的质粒少，这也是一个可能。一般最多摇16个小时吧。
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9楼2012-07-10 19:24:22
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