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汕头大学海洋科学接受调剂
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593318518

新虫 (小有名气)

[求助] 使用E.coli复制质粒,提取质粒产量很低

问题如题,使用invitrogen的TOP 10 Chemically Competent cell作为宿主菌复制PCR2.1 载体携带基因的质粒。culture体积是10ml, 挑单菌落接种,抗性是Gentamicin,我是在菌液OD达到1.5之后才提取质粒的。质粒提取用的是qiagen的试剂盒,最后使用50ulEB洗脱,但是质粒浓度很低。这是为什么了?
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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
首先你的OD略低,而且不知道你提质粒用了多少的菌液?一般是3-5ml,还是在菌液浓度很好的情况下。
2楼2012-07-09 09:00:52
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Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
可以减少洗脱体积,我一般3ml菌液最后用35ul的洗脱体积
Look,ifyouhadoneshot,oroneopportunity,toseizeeverythingyoueverwanted,inonemoment.Wouldyoucaptureit,orjustletitslip?
3楼2012-07-09 09:46:40
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by dshlove at 2012-07-09 09:00:52
首先你的OD略低,而且不知道你提质粒用了多少的菌液?一般是3-5ml,还是在菌液浓度很好的情况下。

是 有点低了,一般提取质粒,是将菌液过夜培养后再提取,OD应该在10以上了吧?
过夜菌液4ml,肯定没问题。
VX:19192310212;公众号:生物技术与IVD
4楼2012-07-09 10:10:17
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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by snoopyzxx at 2012-07-09 10:10:17
是 有点低了,一般提取质粒,是将菌液过夜培养后再提取,OD应该在10以上了吧?
过夜菌液4ml,肯定没问题。...

过夜的,我们一把用3ml就够了。
不知道你说的质粒浓度低,是低到什么程度了啊。
5楼2012-07-09 10:53:22
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)

引用回帖:
5楼: Originally posted by dshlove at 2012-07-09 10:53:22
过夜的,我们一把用3ml就够了。
不知道你说的质粒浓度低,是低到什么程度了啊。...

我说的低是指他的OD值太低。
3ml还是4ml,我觉得倒不是太重要,我提取质粒都是将菌液直接倒入5mlEP管的,估计是4ml左右,没有准确定量,觉得不是主要因素。
VX:19192310212;公众号:生物技术与IVD
6楼2012-07-09 11:12:06
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陈年芬芳

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-07-11 13:40:13
你培养体积很大了,但OD不高,培养的时候盖子不要扭太紧,以免影响溶氧。另外提质粒时,一般4mL菌液(过夜培养)足够。buffer 2孵育一定要2min左右,不要超过4min。洗脱时,将Elution buffer加入后,60度温箱2min,15000离心。
我一般4mL菌液,洗脱体积55uL。浓度基本不低于200 ng/uL,最高时可以提到600 ng/uL。
7楼2012-07-10 16:33:49
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 西瓜斑斑又出现了哈,围观 2012-07-11 13:40:57
OD不是太大问题,一般质粒随便摇都可以的。过夜的我提过,摇6个小时、10个小时的也做过,都ok。
个人认为你的问题是culture用太多了,导致加溶液2时裂解不充分,所以质粒得率低。一般用1.5mL EP管离心收集1~3次就可以了,具体看菌体有多少。10mL绝对是太多啦。
8楼2012-07-10 19:22:18
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

不知道你摇了多久,时间过长的话抗生素抗性都没了,杂菌长起来,这样虽然菌体多,但实际含的质粒少,这也是一个可能。一般最多摇16个小时吧。
9楼2012-07-10 19:24:22
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593318518

新虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by 陈年芬芳 at 2012-07-10 16:33:49
你培养体积很大了,但OD不高,培养的时候盖子不要扭太紧,以免影响溶氧。另外提质粒时,一般4mL菌液(过夜培养)足够。buffer 2孵育一定要2min左右,不要超过4min。洗脱时,将Elution buffer加入后,60度温箱2min, ...

不同机器OD不同,看来我不该说OD指标。总之我摇菌将近24小时,很浓了。是culture tube溶氧应该没问题。就是因为5ml或者几毫升提的质粒量少才换成10ml的。而且buffer1-3都是double了体积。终浓度只有50上下。关键是其他基因我提的都很高,唯独就是这个基因
10楼2012-07-10 23:29:43
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