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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 使用E.coli复制质粒，提取质粒产量很低
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593318518

新虫 (小有名气)

[求助] 使用E.coli复制质粒，提取质粒产量很低

问题如题，使用invitrogen的TOP 10 Chemically Competent cell作为宿主菌复制PCR2.1 载体携带基因的质粒。culture体积是10ml， 挑单菌落接种，抗性是Gentamicin，我是在菌液OD达到1.5之后才提取质粒的。质粒提取用的是qiagen的试剂盒，最后使用50ulEB洗脱，但是质粒浓度很低。这是为什么了？
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1楼 2012-07-08 21:59:32
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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
首先你的OD略低，而且不知道你提质粒用了多少的菌液？一般是3-5ml,还是在菌液浓度很好的情况下。
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2楼2012-07-09 09:00:52
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Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可以减少洗脱体积，我一般3ml菌液最后用35ul的洗脱体积
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Look,ifyouhadoneshot,oroneopportunity,toseizeeverythingyoueverwanted,inonemoment.Wouldyoucaptureit,orjustletitslip?
3楼2012-07-09 09:46:40
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by dshlove at 2012-07-09 09:00:52
首先你的OD略低，而且不知道你提质粒用了多少的菌液？一般是3-5ml,还是在菌液浓度很好的情况下。

是 有点低了，一般提取质粒，是将菌液过夜培养后再提取，OD应该在10以上了吧？
过夜菌液4ml，肯定没问题。
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4楼2012-07-09 10:10:17
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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by snoopyzxx at 2012-07-09 10:10:17
是 有点低了，一般提取质粒，是将菌液过夜培养后再提取，OD应该在10以上了吧？
过夜菌液4ml，肯定没问题。...

过夜的，我们一把用3ml就够了。
不知道你说的质粒浓度低，是低到什么程度了啊。
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5楼2012-07-09 10:53:22
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by dshlove at 2012-07-09 10:53:22
过夜的，我们一把用3ml就够了。
不知道你说的质粒浓度低，是低到什么程度了啊。...

我说的低是指他的OD值太低。
3ml还是4ml，我觉得倒不是太重要，我提取质粒都是将菌液直接倒入5mlEP管的，估计是4ml左右，没有准确定量，觉得不是主要因素。
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6楼2012-07-09 11:12:06
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陈年芬芳

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-07-11 13:40:13
你培养体积很大了，但OD不高，培养的时候盖子不要扭太紧，以免影响溶氧。另外提质粒时，一般4mL菌液（过夜培养）足够。buffer 2孵育一定要2min左右，不要超过4min。洗脱时，将Elution buffer加入后，60度温箱2min，15000离心。
我一般4mL菌液，洗脱体积55uL。浓度基本不低于200 ng/uL，最高时可以提到600 ng/uL。
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7楼2012-07-10 16:33:49
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 西瓜斑斑又出现了哈，围观 2012-07-11 13:40:57
OD不是太大问题，一般质粒随便摇都可以的。过夜的我提过，摇6个小时、10个小时的也做过，都ok。
个人认为你的问题是culture用太多了，导致加溶液2时裂解不充分，所以质粒得率低。一般用1.5mL EP管离心收集1~3次就可以了，具体看菌体有多少。10mL绝对是太多啦。
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8楼2012-07-10 19:22:18
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

不知道你摇了多久，时间过长的话抗生素抗性都没了，杂菌长起来，这样虽然菌体多，但实际含的质粒少，这也是一个可能。一般最多摇16个小时吧。
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9楼2012-07-10 19:24:22
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593318518

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 陈年芬芳 at 2012-07-10 16:33:49
你培养体积很大了，但OD不高，培养的时候盖子不要扭太紧，以免影响溶氧。另外提质粒时，一般4mL菌液（过夜培养）足够。buffer 2孵育一定要2min左右，不要超过4min。洗脱时，将Elution buffer加入后，60度温箱2min， ...

不同机器OD不同，看来我不该说OD指标。总之我摇菌将近24小时，很浓了。是culture tube溶氧应该没问题。就是因为5ml或者几毫升提的质粒量少才换成10ml的。而且buffer1-3都是double了体积。终浓度只有50上下。关键是其他基因我提的都很高，唯独就是这个基因
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10楼2012-07-10 23:29:43
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