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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 带HIS标签的可溶蛋白的纯化问题
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shengnan1987

铁虫 (初入文坛)

[求助] 带HIS标签的可溶蛋白的纯化问题

我做的是一种蛋白酶的原核表达，c端带一个his标签，大小31kd，等电点10，pet24a可溶表达，但表达量不高，不到50%，用镍柱纯化，Binding: 20 mM sodium phosphate, 20 mM Imidazole,500 mM  NaCl, PH 8.0
Elution: 20 mM sodium phosphate, 500 mM Imidazole,
500 mM  NaCl, PH8.0
调整咪唑的浓度，要么峰型好，但杂带还是很多；要么没有特异的峰出现。请问各位高手有没有好的纯化方法？非常感谢
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走自己的路
1楼 2012-05-27 13:06:47
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, MolEPI+1, 鼓励热心应助，谢谢分享经验 2012-05-29 16:07:57
我有个疑问，你为什么不同时使用磷酸二氢钠和磷酸氢二钠做的缓冲体系呢？
给你点建议，参考下。
你可以试试Tris。NaCl的浓度可以提高到 1 M。而且你可以再将缓冲液pH降到7.0，同时你养的菌可以将诱导温度还有IPTG都降低，这样很大一部分会避免标签被包裹起来。
针对你说的洗脱的问题，我觉得只要有蛋白，那都不是问题了，你不能指望过个his柱就一劳永逸的能将你的蛋白很好的分开。如果需要，你后续还是要过S柱或者分子筛的。
要是你不着急的话，建议你先少量蛋白用Imidazole拉个线性试试，确定能洗下杂蛋白的最佳咪唑浓度。再用阶梯去洗。
等你用阶梯洗的时候，可以在目的蛋白能被洗脱的浓度之前用咪唑大量洗杂，等基线走平再去阶梯洗，分主峰和拖尾峰分别收集，然后再提高咪唑浓度，依上面方法逐步洗脱。跑胶后取舍，再做下一步纯化。
总之，如果线性效果不明显，你可以拿一批直接去摸条件。什么75mM，100mM，150mM，200mM都去试试。
祝你好运啊。
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shengnan1987
11楼2012-05-29 15:08:33
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radium4046

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-29 18:54:01
用梯度洗啊，50-100-250-500，或者拉个20~500的线性；你用的什么镍柱呢，是预装的还是自己填的，是IDA还是NTA，NTA特异结合好一点，不过有条件的话用GE的预装柱效果更好；峰形好的时候，你是把峰pool到一起跑的电泳还是分段跑的？有时候一个峰的前半段 峰值和后半段，跑出来SDS是不一样的~
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9楼2012-05-28 15:39:16
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普通回帖

孙启亮

金虫 (著名写手)
西瓜: 金币-40, 2楼赞助楼主散金 2012-05-27 18:43:25
西瓜: 金币-40, 2楼赞助楼主散金 2012-05-27 18:43:36
西瓜: 金币-20, 2楼赞助楼主散金。共100金币。 2012-05-27 18:44:08
西瓜: 金币+50, 返回之前赞助金币 2012-06-04 14:35:09
西瓜: 金币+50, 返回之前赞助金币 2012-06-04 14:35:18
我回帖赞助你金币，1个BB太少了
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shengnan1987
2楼2012-05-27 18:39:39
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shengnan1987

铁虫 (初入文坛)
送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by 孙启亮 at 2012-05-27 18:39:39
我回帖赞助你金币，1个BB太少了

谢谢！没经验
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走自己的路
3楼2012-05-27 22:44:51
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anzaigtt

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
如果是“表达量”不高，那是培养体系的问题。和纯化关系不大。
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4楼2012-05-28 07:56:14
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sayaya

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-28 16:02:54
要么峰型好，但杂带还是很多；要么没有特异的峰出现-----

说明挂柱效果不好。要么是柱（树脂）的问题，要么是蛋白的问题（如蛋白结构中His-tag内包）。
可以考虑增加树脂量或更换树脂或活化柱子，进行蛋白变复性，使His-tag外露。
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5楼2012-05-28 08:06:39
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kedaxiaoyu

木虫 (职业作家)

神虫浮云

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
走过梯度没？没有的话可以走个咪唑的洗脱梯度试试。
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6楼2012-05-28 10:20:57
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孙启亮

金虫 (著名写手)
西瓜: , 我通知楼主了，等等看吧 2012-05-29 18:53:47
引用回帖:
2楼: Originally posted by 孙启亮 at 2012-05-27 18:39:39
我回帖赞助你金币，1个BB太少了

姑娘，将我赞助的金币设为悬赏金币啊，这样会有人帮助你，同时我也想知道答案
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7楼2012-05-28 12:17:01
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jasonwyb123

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+3, Good！ 2012-05-29 18:53:56
表达量不高，和纯化有一定的关系，但主要还是看你的菌株表达问题，你的蛋白在包涵体内多吗？如果不多，那就排除这个问题。
你可以在洗脱之前多加几个梯度去洗杂带， 我以前是手动纯化的，所以对你说的峰之类的可能不是很了解，但我做HPLC，应该也明白，如果浓度不高，在同一个菌株的情况下，你可以选择浓缩，用浓缩管就可以，很方便
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8楼2012-05-28 14:49:17
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loveskyzhou

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-29 18:54:11
不重新构建的话不用改太多了，经常见到文章里的图也是这样，有去不掉的杂带，过两个柱子也不大好用。我也遇到过，至今没办法，但蛋白凑合能用。
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我会绕一个圈，走回到实验室
10楼2012-05-29 14:11:30
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