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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, MolEPI+1, 鼓励热心应助,谢谢分享经验 2012-05-29 16:07:57
我有个疑问,你为什么不同时使用磷酸二氢钠和磷酸氢二钠做的缓冲体系呢?
给你点建议,参考下。
你可以试试Tris。NaCl的浓度可以提高到 1 M。而且你可以再将缓冲液pH降到7.0,同时你养的菌可以将诱导温度还有IPTG都降低,这样很大一部分会避免标签被包裹起来。
针对你说的洗脱的问题,我觉得只要有蛋白,那都不是问题了,你不能指望过个his柱就一劳永逸的能将你的蛋白很好的分开。如果需要,你后续还是要过S柱或者分子筛的。
要是你不着急的话,建议你先少量蛋白用Imidazole拉个线性试试,确定能洗下杂蛋白的最佳咪唑浓度。再用阶梯去洗。
等你用阶梯洗的时候,可以在目的蛋白能被洗脱的浓度之前用咪唑大量洗杂,等基线走平再去阶梯洗,分主峰和拖尾峰分别收集,然后再提高咪唑浓度,依上面方法逐步洗脱。跑胶后取舍,再做下一步纯化。
总之,如果线性效果不明显,你可以拿一批直接去摸条件。什么75mM,100mM,150mM,200mM都去试试。
祝你好运啊。

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11楼2012-05-29 15:08:33
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