24小时热门版块排行榜    

CyRhmU.jpeg
查看: 3567  |  回复: 20
本帖产生 1 个 MolEPI ,点击这里进行查看
当前只显示满足指定条件的回帖,点击这里查看本话题的所有回帖

shengnan1987

铁虫 (初入文坛)

[求助] 带HIS标签的可溶蛋白的纯化问题

我做的是一种蛋白酶的原核表达,c端带一个his标签,大小31kd,等电点10,pet24a可溶表达,但表达量不高,不到50%,用镍柱纯化,Binding: 20 mM sodium phosphate, 20 mM Imidazole,500 mM  NaCl, PH 8.0
Elution: 20 mM sodium phosphate, 500 mM Imidazole,
500 mM  NaCl, PH8.0
调整咪唑的浓度,要么峰型好,但杂带还是很多;要么没有特异的峰出现。请问各位高手有没有好的纯化方法?非常感谢
回复此楼
走自己的路
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shengnan1987

铁虫 (初入文坛)

送鲜花一朵
引用回帖:
11楼: Originally posted by dshlove at 2012-05-29 15:08:33
我有个疑问,你为什么不同时使用磷酸二氢钠和磷酸氢二钠做的缓冲体系呢?
给你点建议,参考下。
你可以试试Tris。NaCl的浓度可以提高到 1 M。而且你可以再将缓冲液pH降到7.0,同时你养的菌可以将诱导温度还有IPTG ...

谢谢,我会考虑您的方法!使用磷酸二氢钠和磷酸氢二钠有什么好处呢?我是根据文献和别人的经验选的体系,诱导温度还有IPTG都降低,表达量会更低,我最近一直在想办法增加表达量,但是条件一高,就表达的是包涵体,我想尽可能按可溶的做。我的蛋白pi在10,ph调到7.0是不是太少了?现在只能尽可能筛选纯化条件,请问如果标签包裹起来,重生cuso4柱子会不会效果好点?洗杂和洗脱时咪唑线性范围多少适宜啊
走自己的路
12楼2012-06-27 22:57:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 21 个回答

孙启亮

金虫 (著名写手)

西瓜: 金币-40, 2楼赞助楼主散金 2012-05-27 18:43:25
西瓜: 金币-40, 2楼赞助楼主散金 2012-05-27 18:43:36
西瓜: 金币-20, 2楼赞助楼主散金。共100金币。 2012-05-27 18:44:08
西瓜: 金币+50, 返回之前赞助金币 2012-06-04 14:35:09
西瓜: 金币+50, 返回之前赞助金币 2012-06-04 14:35:18
我回帖赞助你金币,1个BB太少了

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

2楼2012-05-27 18:39:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shengnan1987

铁虫 (初入文坛)

送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by 孙启亮 at 2012-05-27 18:39:39
我回帖赞助你金币,1个BB太少了

谢谢!没经验
走自己的路
3楼2012-05-27 22:44:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

anzaigtt

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
如果是“表达量”不高,那是培养体系的问题。和纯化关系不大。
4楼2012-05-28 07:56:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
信息提示
请填处理意见