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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 带HIS标签的可溶蛋白的纯化问题
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shengnan1987

铁虫 (初入文坛)

[求助] 带HIS标签的可溶蛋白的纯化问题

我做的是一种蛋白酶的原核表达，c端带一个his标签，大小31kd，等电点10，pet24a可溶表达，但表达量不高，不到50%，用镍柱纯化，Binding: 20 mM sodium phosphate, 20 mM Imidazole,500 mM  NaCl, PH 8.0
Elution: 20 mM sodium phosphate, 500 mM Imidazole,
500 mM  NaCl, PH8.0
调整咪唑的浓度，要么峰型好，但杂带还是很多；要么没有特异的峰出现。请问各位高手有没有好的纯化方法？非常感谢
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走自己的路
1楼 2012-05-27 13:06:47
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shengnan1987

铁虫 (初入文坛)
送鲜花一朵
引用回帖:
11楼: Originally posted by dshlove at 2012-05-29 15:08:33
我有个疑问，你为什么不同时使用磷酸二氢钠和磷酸氢二钠做的缓冲体系呢？
给你点建议，参考下。
你可以试试Tris。NaCl的浓度可以提高到 1 M。而且你可以再将缓冲液pH降到7.0，同时你养的菌可以将诱导温度还有IPTG ...

谢谢，我会考虑您的方法！使用磷酸二氢钠和磷酸氢二钠有什么好处呢？我是根据文献和别人的经验选的体系，诱导温度还有IPTG都降低，表达量会更低，我最近一直在想办法增加表达量，但是条件一高，就表达的是包涵体，我想尽可能按可溶的做。我的蛋白pi在10，ph调到7.0是不是太少了？现在只能尽可能筛选纯化条件，请问如果标签包裹起来，重生cuso4柱子会不会效果好点？洗杂和洗脱时咪唑线性范围多少适宜啊
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走自己的路
12楼2012-06-27 22:57:25
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孙启亮

金虫 (著名写手)
西瓜: 金币-40, 2楼赞助楼主散金 2012-05-27 18:43:25
西瓜: 金币-40, 2楼赞助楼主散金 2012-05-27 18:43:36
西瓜: 金币-20, 2楼赞助楼主散金。共100金币。 2012-05-27 18:44:08
西瓜: 金币+50, 返回之前赞助金币 2012-06-04 14:35:09
西瓜: 金币+50, 返回之前赞助金币 2012-06-04 14:35:18
我回帖赞助你金币，1个BB太少了
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shengnan1987
2楼2012-05-27 18:39:39
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shengnan1987

铁虫 (初入文坛)
送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by 孙启亮 at 2012-05-27 18:39:39
我回帖赞助你金币，1个BB太少了

谢谢！没经验
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走自己的路
3楼2012-05-27 22:44:51
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anzaigtt

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
如果是“表达量”不高，那是培养体系的问题。和纯化关系不大。
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4楼2012-05-28 07:56:14
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