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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 带HIS标签的可溶蛋白的纯化问题
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shengnan1987

铁虫 (初入文坛)

[求助] 带HIS标签的可溶蛋白的纯化问题

我做的是一种蛋白酶的原核表达，c端带一个his标签，大小31kd，等电点10，pet24a可溶表达，但表达量不高，不到50%，用镍柱纯化，Binding: 20 mM sodium phosphate, 20 mM Imidazole,500 mM  NaCl, PH 8.0
Elution: 20 mM sodium phosphate, 500 mM Imidazole,
500 mM  NaCl, PH8.0
调整咪唑的浓度，要么峰型好，但杂带还是很多；要么没有特异的峰出现。请问各位高手有没有好的纯化方法？非常感谢
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走自己的路
1楼2012-05-27 13:06:47
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shengnan1987

铁虫 (初入文坛)
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2楼: Originally posted by 孙启亮 at 2012-05-27 18:39:39
我回帖赞助你金币，1个BB太少了

谢谢！没经验
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走自己的路
3楼2012-05-27 22:44:51
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shengnan1987

铁虫 (初入文坛)
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11楼: Originally posted by dshlove at 2012-05-29 15:08:33
我有个疑问，你为什么不同时使用磷酸二氢钠和磷酸氢二钠做的缓冲体系呢？
给你点建议，参考下。
你可以试试Tris。NaCl的浓度可以提高到 1 M。而且你可以再将缓冲液pH降到7.0，同时你养的菌可以将诱导温度还有IPTG ...

谢谢，我会考虑您的方法！使用磷酸二氢钠和磷酸氢二钠有什么好处呢？我是根据文献和别人的经验选的体系，诱导温度还有IPTG都降低，表达量会更低，我最近一直在想办法增加表达量，但是条件一高，就表达的是包涵体，我想尽可能按可溶的做。我的蛋白pi在10，ph调到7.0是不是太少了？现在只能尽可能筛选纯化条件，请问如果标签包裹起来，重生cuso4柱子会不会效果好点？洗杂和洗脱时咪唑线性范围多少适宜啊
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走自己的路
12楼2012-06-27 22:57:25
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shengnan1987

铁虫 (初入文坛)
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4楼: Originally posted by anzaigtt at 2012-05-28 07:56:14
如果是“表达量”不高，那是培养体系的问题。和纯化关系不大。

表达量我已经摸索了iptg诱导剂量，诱导时间，温度，转速等，最后也只能按照现有表达量做，现在就希望它能纯化出来
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走自己的路
13楼2012-06-27 23:00:10
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shengnan1987

铁虫 (初入文坛)
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5楼: Originally posted by sayaya at 2012-05-28 08:06:39
要么峰型好，但杂带还是很多；要么没有特异的峰出现-----

说明挂柱效果不好。要么是柱（树脂）的问题，要么是蛋白的问题（如蛋白结构中His-tag内包）。
可以考虑增加树脂量或更换树脂或活化柱子，进行蛋白变复性 ...

我们使用的是GE的his预装柱，之前别人是能正常使用的，怎么增加树脂量或更换树脂或活化柱子？我不想对蛋白变复性，它是新分子，对后面活性和功能研究说不清吧！还需要对二级结构进行鉴定
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走自己的路
14楼2012-06-27 23:03:50
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shengnan1987

铁虫 (初入文坛)
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6楼: Originally posted by kedaxiaoyu at 2012-05-28 10:20:57
走过梯度没？没有的话可以走个咪唑的洗脱梯度试试。

恩
15楼2012-06-27 23:04:00
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shengnan1987

铁虫 (初入文坛)
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8楼: Originally posted by jasonwyb123 at 2012-05-28 14:49:17
表达量不高，和纯化有一定的关系，但主要还是看你的菌株表达问题，你的蛋白在包涵体内多吗？如果不多，那就排除这个问题。
你可以在洗脱之前多加几个梯度去洗杂带， 我以前是手动纯化的，所以对你说的峰之类的可能 ...

在现有条件或更低条件很少或没有包涵体，稍微高一点就是包涵体了，我的蛋白是在rostta(de3)中表达的，表达比bl21少得多，有人建议我用hplc进行精心纯化，不知道可行吗？先过离子交换柱是不是会先去掉一些杂质？但我不知道选择阳离子还是阴离子交换柱？缓冲液怎么选择呢？浓度是由我我接的细菌量决定的，所以这个不是问题
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走自己的路
16楼2012-06-27 23:12:23
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shengnan1987

铁虫 (初入文坛)
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9楼: Originally posted by radium4046 at 2012-05-28 15:39:16
用梯度洗啊，50-100-250-500，或者拉个20~500的线性；你用的什么镍柱呢，是预装的还是自己填的，是IDA还是NTA，NTA特异结合好一点，不过有条件的话用GE的预装柱效果更好；峰形好的时候，你是把峰pool到一起跑的电泳 ...

恩，我下次试试梯度洗，我用的是GE的预装柱，买了没多久，之前没用过几次，是IDA还是NTA我回去再查查，峰型好的时候峰很尖的，没有拖尾，收到一起大约几百微升，没办法再细分了
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走自己的路
17楼2012-06-27 23:19:23
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shengnan1987

铁虫 (初入文坛)
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18楼: Originally posted by dshlove at 2012-06-29 14:18:41
磷酸二氢钠和磷酸氢二钠缓冲体系，首先，磷酸基团是阴离子基团，你的蛋白PI是10，缓冲液的pH要低于10 ，便于上S柱，这个缓冲液就很理想了。还有，就是它的缓冲范围和TRIS是不同的。Tris不行就能试试这个缓冲液了。 ...

恩 我会都试试的，谢谢你！有问题我再请教
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走自己的路
19楼2012-06-29 22:33:13
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