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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 带HIS标签的可溶蛋白的纯化问题
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shengnan1987

铁虫 (初入文坛)

[求助] 带HIS标签的可溶蛋白的纯化问题

我做的是一种蛋白酶的原核表达，c端带一个his标签，大小31kd，等电点10，pet24a可溶表达，但表达量不高，不到50%，用镍柱纯化，Binding: 20 mM sodium phosphate, 20 mM Imidazole,500 mM  NaCl, PH 8.0
Elution: 20 mM sodium phosphate, 500 mM Imidazole,
500 mM  NaCl, PH8.0
调整咪唑的浓度，要么峰型好，但杂带还是很多；要么没有特异的峰出现。请问各位高手有没有好的纯化方法？非常感谢
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走自己的路
1楼 2012-05-27 13:06:47
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shengnan1987

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by jasonwyb123 at 2012-05-28 14:49:17
表达量不高，和纯化有一定的关系，但主要还是看你的菌株表达问题，你的蛋白在包涵体内多吗？如果不多，那就排除这个问题。
你可以在洗脱之前多加几个梯度去洗杂带， 我以前是手动纯化的，所以对你说的峰之类的可能 ...

在现有条件或更低条件很少或没有包涵体，稍微高一点就是包涵体了，我的蛋白是在rostta(de3)中表达的，表达比bl21少得多，有人建议我用hplc进行精心纯化，不知道可行吗？先过离子交换柱是不是会先去掉一些杂质？但我不知道选择阳离子还是阴离子交换柱？缓冲液怎么选择呢？浓度是由我我接的细菌量决定的，所以这个不是问题
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走自己的路
16楼2012-06-27 23:12:23
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孙启亮

金虫 (著名写手)
西瓜: 金币-40, 2楼赞助楼主散金 2012-05-27 18:43:25
西瓜: 金币-40, 2楼赞助楼主散金 2012-05-27 18:43:36
西瓜: 金币-20, 2楼赞助楼主散金。共100金币。 2012-05-27 18:44:08
西瓜: 金币+50, 返回之前赞助金币 2012-06-04 14:35:09
西瓜: 金币+50, 返回之前赞助金币 2012-06-04 14:35:18
我回帖赞助你金币，1个BB太少了
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shengnan1987
2楼2012-05-27 18:39:39
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shengnan1987

铁虫 (初入文坛)
送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by 孙启亮 at 2012-05-27 18:39:39
我回帖赞助你金币，1个BB太少了

谢谢！没经验
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走自己的路
3楼2012-05-27 22:44:51
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anzaigtt

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
如果是“表达量”不高，那是培养体系的问题。和纯化关系不大。
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4楼2012-05-28 07:56:14
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查看全部 21 个回答
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