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shengnan1987铁虫 (初入文坛)
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带HIS标签的可溶蛋白的纯化问题
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我做的是一种蛋白酶的原核表达，c端带一个his标签，大小31kd，等电点10，pet24a可溶表达，但表达量不高，不到50%，用镍柱纯化，Binding: 20 mM sodium phosphate, 20 mM Imidazole,500 mM NaCl, PH 8.0 Elution: 20 mM sodium phosphate, 500 mM Imidazole, 500 mM NaCl, PH8.0 调整咪唑的浓度，要么峰型好，但杂带还是很多；要么没有特异的峰出现。请问各位高手有没有好的纯化方法？非常感谢 |
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 【分子生物】EPI帖 |
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【答案】应助回帖
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小丹木木: 金币+3, MolEPI+1, 鼓励热心应助，谢谢分享经验 2012-05-29 16:07:57
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, MolEPI+1, 鼓励热心应助，谢谢分享经验 2012-05-29 16:07:57
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我有个疑问，你为什么不同时使用磷酸二氢钠和磷酸氢二钠做的缓冲体系呢？ 给你点建议，参考下。 你可以试试Tris。NaCl的浓度可以提高到 1 M。而且你可以再将缓冲液pH降到7.0，同时你养的菌可以将诱导温度还有IPTG都降低，这样很大一部分会避免标签被包裹起来。 针对你说的洗脱的问题，我觉得只要有蛋白，那都不是问题了，你不能指望过个his柱就一劳永逸的能将你的蛋白很好的分开。如果需要，你后续还是要过S柱或者分子筛的。 要是你不着急的话，建议你先少量蛋白用Imidazole拉个线性试试，确定能洗下杂蛋白的最佳咪唑浓度。再用阶梯去洗。 等你用阶梯洗的时候，可以在目的蛋白能被洗脱的浓度之前用咪唑大量洗杂，等基线走平再去阶梯洗，分主峰和拖尾峰分别收集，然后再提高咪唑浓度，依上面方法逐步洗脱。跑胶后取舍，再做下一步纯化。 总之，如果线性效果不明显，你可以拿一批直接去摸条件。什么75mM，100mM，150mM，200mM都去试试。 祝你好运啊。 |
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shengnan198711楼2012-05-29 15:08:33
9楼2012-05-28 15:39:16
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shengnan1987
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