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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 带HIS标签的可溶蛋白的纯化问题
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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, MolEPI+1, 鼓励热心应助，谢谢分享经验 2012-05-29 16:07:57
我有个疑问，你为什么不同时使用磷酸二氢钠和磷酸氢二钠做的缓冲体系呢？
给你点建议，参考下。
你可以试试Tris。NaCl的浓度可以提高到 1 M。而且你可以再将缓冲液pH降到7.0，同时你养的菌可以将诱导温度还有IPTG都降低，这样很大一部分会避免标签被包裹起来。
针对你说的洗脱的问题，我觉得只要有蛋白，那都不是问题了，你不能指望过个his柱就一劳永逸的能将你的蛋白很好的分开。如果需要，你后续还是要过S柱或者分子筛的。
要是你不着急的话，建议你先少量蛋白用Imidazole拉个线性试试，确定能洗下杂蛋白的最佳咪唑浓度。再用阶梯去洗。
等你用阶梯洗的时候，可以在目的蛋白能被洗脱的浓度之前用咪唑大量洗杂，等基线走平再去阶梯洗，分主峰和拖尾峰分别收集，然后再提高咪唑浓度，依上面方法逐步洗脱。跑胶后取舍，再做下一步纯化。
总之，如果线性效果不明显，你可以拿一批直接去摸条件。什么75mM，100mM，150mM，200mM都去试试。
祝你好运啊。
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shengnan1987
11楼2012-05-29 15:08:33
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shengnan1987

铁虫 (初入文坛)
送鲜花一朵
引用回帖:
11楼: Originally posted by dshlove at 2012-05-29 15:08:33
我有个疑问，你为什么不同时使用磷酸二氢钠和磷酸氢二钠做的缓冲体系呢？
给你点建议，参考下。
你可以试试Tris。NaCl的浓度可以提高到 1 M。而且你可以再将缓冲液pH降到7.0，同时你养的菌可以将诱导温度还有IPTG ...

谢谢，我会考虑您的方法！使用磷酸二氢钠和磷酸氢二钠有什么好处呢？我是根据文献和别人的经验选的体系，诱导温度还有IPTG都降低，表达量会更低，我最近一直在想办法增加表达量，但是条件一高，就表达的是包涵体，我想尽可能按可溶的做。我的蛋白pi在10，ph调到7.0是不是太少了？现在只能尽可能筛选纯化条件，请问如果标签包裹起来，重生cuso4柱子会不会效果好点？洗杂和洗脱时咪唑线性范围多少适宜啊
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走自己的路
12楼2012-06-27 22:57:25
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shengnan1987

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by anzaigtt at 2012-05-28 07:56:14
如果是“表达量”不高，那是培养体系的问题。和纯化关系不大。

表达量我已经摸索了iptg诱导剂量，诱导时间，温度，转速等，最后也只能按照现有表达量做，现在就希望它能纯化出来
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走自己的路
13楼2012-06-27 23:00:10
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shengnan1987

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by sayaya at 2012-05-28 08:06:39
要么峰型好，但杂带还是很多；要么没有特异的峰出现-----

说明挂柱效果不好。要么是柱（树脂）的问题，要么是蛋白的问题（如蛋白结构中His-tag内包）。
可以考虑增加树脂量或更换树脂或活化柱子，进行蛋白变复性 ...

我们使用的是GE的his预装柱，之前别人是能正常使用的，怎么增加树脂量或更换树脂或活化柱子？我不想对蛋白变复性，它是新分子，对后面活性和功能研究说不清吧！还需要对二级结构进行鉴定
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走自己的路
14楼2012-06-27 23:03:50
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shengnan1987

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by kedaxiaoyu at 2012-05-28 10:20:57
走过梯度没？没有的话可以走个咪唑的洗脱梯度试试。

恩
15楼2012-06-27 23:04:00
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shengnan1987

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by jasonwyb123 at 2012-05-28 14:49:17
表达量不高，和纯化有一定的关系，但主要还是看你的菌株表达问题，你的蛋白在包涵体内多吗？如果不多，那就排除这个问题。
你可以在洗脱之前多加几个梯度去洗杂带， 我以前是手动纯化的，所以对你说的峰之类的可能 ...

在现有条件或更低条件很少或没有包涵体，稍微高一点就是包涵体了，我的蛋白是在rostta(de3)中表达的，表达比bl21少得多，有人建议我用hplc进行精心纯化，不知道可行吗？先过离子交换柱是不是会先去掉一些杂质？但我不知道选择阳离子还是阴离子交换柱？缓冲液怎么选择呢？浓度是由我我接的细菌量决定的，所以这个不是问题
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走自己的路
16楼2012-06-27 23:12:23
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shengnan1987

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by radium4046 at 2012-05-28 15:39:16
用梯度洗啊，50-100-250-500，或者拉个20~500的线性；你用的什么镍柱呢，是预装的还是自己填的，是IDA还是NTA，NTA特异结合好一点，不过有条件的话用GE的预装柱效果更好；峰形好的时候，你是把峰pool到一起跑的电泳 ...

恩，我下次试试梯度洗，我用的是GE的预装柱，买了没多久，之前没用过几次，是IDA还是NTA我回去再查查，峰型好的时候峰很尖的，没有拖尾，收到一起大约几百微升，没办法再细分了
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走自己的路
17楼2012-06-27 23:19:23
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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
12楼: Originally posted by shengnan1987 at 2012-06-27 22:57:25
谢谢，我会考虑您的方法！使用磷酸二氢钠和磷酸氢二钠有什么好处呢？我是根据文献和别人的经验选的体系，诱导温度还有IPTG都降低，表达量会更低，我最近一直在想办法增加表达量，但是条件一高，就表达的是包涵体， ...

磷酸二氢钠和磷酸氢二钠缓冲体系，首先，磷酸基团是阴离子基团，你的蛋白PI是10，缓冲液的pH要低于10 ，便于上S柱，这个缓冲液就很理想了。还有，就是它的缓冲范围和TRIS是不同的。Tris不行就能试试这个缓冲液了。
其实有时候表达量低但是蛋白可溶和表达量高形成包涵体，我想，怎么选择，你是很清楚的。怕的是表达量低还他娘形成包涵体！
你说的pH没必要到7.0，到7.5就差不多了，还有就是，每个蛋白都有合适pH，选择不当虽然初期纯化没什么问题，到后期纯化，蛋白浓度一高，浓缩什么的，就会沉淀，很坑的！
Cu的柱子，我没用过，我用的一直是Ni的，其实原理差不多，没什么实质性差异，标签包裹起来，还想亲和纯化的话就要变复性了，这个考虑的就多了。至于你说的咪唑范围，我前面说的，你去试，每个蛋白不同，就算同种蛋白，每个批次也是不太一样的，所以我不能给你确切的范围，建议是上完样后，先用破细胞BUFFER大量冲洗，一根柱子要100Ml，再用10mM咪唑，20mM咪唑，分别冲洗2-3个柱体积，最后用300mM洗脱下来。
记得及时平衡柱子哦。
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18楼2012-06-29 14:18:41
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shengnan1987

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
18楼: Originally posted by dshlove at 2012-06-29 14:18:41
磷酸二氢钠和磷酸氢二钠缓冲体系，首先，磷酸基团是阴离子基团，你的蛋白PI是10，缓冲液的pH要低于10 ，便于上S柱，这个缓冲液就很理想了。还有，就是它的缓冲范围和TRIS是不同的。Tris不行就能试试这个缓冲液了。 ...

恩 我会都试试的，谢谢你！有问题我再请教
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走自己的路
19楼2012-06-29 22:33:13
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edoz1986

新虫 (小有名气)
用20mm  imi的上样，最好中间加一个50mm的imi继续洗杂。再一个可能就是你的蛋白降解了，那么带his标签的降解带也会挂柱子，建议用wb检测一下是否降解带。
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20楼2013-05-23 09:35:06
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