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shengnan1987

铁虫 (初入文坛)

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[求助] 带HIS标签的可溶蛋白的纯化问题

我做的是一种蛋白酶的原核表达，c端带一个his标签，大小31kd，等电点10，pet24a可溶表达，但表达量不高，不到50%，用镍柱纯化，Binding: 20 mM sodium phosphate, 20 mM Imidazole,500 mM NaCl, PH 8.0
Elution: 20 mM sodium phosphate, 500 mM Imidazole,
500 mM NaCl, PH8.0
调整咪唑的浓度，要么峰型好，但杂带还是很多；要么没有特异的峰出现。请问各位高手有没有好的纯化方法？非常感谢

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走自己的路

1楼 2012-05-27 13:06:47

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dshlove

木虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

引用回帖:

12楼: Originally posted by shengnan1987 at 2012-06-27 22:57:25
谢谢，我会考虑您的方法！使用磷酸二氢钠和磷酸氢二钠有什么好处呢？我是根据文献和别人的经验选的体系，诱导温度还有IPTG都降低，表达量会更低，我最近一直在想办法增加表达量，但是条件一高，就表达的是包涵体， ...

磷酸二氢钠和磷酸氢二钠缓冲体系，首先，磷酸基团是阴离子基团，你的蛋白PI是10，缓冲液的pH要低于10 ，便于上S柱，这个缓冲液就很理想了。还有，就是它的缓冲范围和TRIS是不同的。Tris不行就能试试这个缓冲液了。
其实有时候表达量低但是蛋白可溶和表达量高形成包涵体，我想，怎么选择，你是很清楚的。怕的是表达量低还他娘形成包涵体！
你说的pH没必要到7.0，到7.5就差不多了，还有就是，每个蛋白都有合适pH，选择不当虽然初期纯化没什么问题，到后期纯化，蛋白浓度一高，浓缩什么的，就会沉淀，很坑的！
Cu的柱子，我没用过，我用的一直是Ni的，其实原理差不多，没什么实质性差异，标签包裹起来，还想亲和纯化的话就要变复性了，这个考虑的就多了。至于你说的咪唑范围，我前面说的，你去试，每个蛋白不同，就算同种蛋白，每个批次也是不太一样的，所以我不能给你确切的范围，建议是上完样后，先用破细胞BUFFER大量冲洗，一根柱子要100Ml，再用10mM咪唑，20mM咪唑，分别冲洗2-3个柱体积，最后用300mM洗脱下来。
记得及时平衡柱子哦。

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18楼2012-06-29 14:18:41

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孙启亮

金虫 (著名写手)

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西瓜: 金币+50, 返回之前赞助金币 2012-06-04 14:35:18

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