| 查看: 2707 | 回复: 22 | |||
[交流]
质粒构建疑难杂症
|
|||
|
本人近期构建质粒碰到一些问题在这里想很大家一起讨论： 1：载体和目的片段酶切，回收后连接转化提质粒后回发现有很多空载，我想其可能原因之一是载体发生了单酶切，其二载体没有切开。可是我是过夜酶切应该能是切开的，若果载体没有切开那么在切胶回收时也是可以分开的，有点疑惑。 对于转化后的空载问题各位是怎样避免的。 2：近期转化后提质粒发现很多质粒比空载小1000-2000bp,有的也比空载小点，出现这种情况有点疑惑了。我酶是用ECOR1和XHO1。 3：我pcr目的基因由TAQ酶可以很好扩增出来，可PFU始终不可以，不知大家有没有什么提高TAQ酶保真性的方法。 4;大家认为在克隆基因方面的一些关键点。 |
回复此楼» 猜你喜欢
留学--博士招生
已经有16人回复
-
化学工程，本211，求调剂，ab区不限
已经有4人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有285人回复
-
湖北师范大学招调剂啦
已经有9人回复
-
邵阳学院食品与化学工程学院硕士调剂
已经有0人回复
-
天津商业大学 生物与医药课题组招生
已经有0人回复
-
生物化工学硕招收调剂
已经有0人回复
-
广东石油化工学院2026年硕士研究生需要多名生物，制药工程，食品专业的调剂生
已经有0人回复
-
317分 一志愿江南大学 化学工程学硕 求调剂
已经有6人回复
-
化工申博
已经有3人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 构建质粒时 质粒上的ATG与目的基因ATG 的问题
已经有4人回复
- 真核表达质粒构建
已经有4人回复
- 质粒构建
已经有13人回复
- 关于质粒的构建
已经有17人回复
- 如何根据已有质粒构建不同开放阅读框的质粒
已经有3人回复
- 重组质粒构建疑难问题
已经有3人回复
- 【求助/交流】构建质粒问题
已经有8人回复
- 【求助/交流】构建表达质粒
已经有12人回复
- 【求助/交流】关于重组质粒的构建，总是失败，希望高手指点一下啊～～
已经有16人回复
- 【求助/交流】有哪位高手指点 表达质粒 的构建
已经有7人回复
- 【求助/交流】质粒PCR产物的回收（质粒构建）
已经有11人回复
- 【求助/交流】质粒构建步骤，回答的好，还有几十金币追加！！！！
已经有13人回复
- 【求助/交流】关于质粒构建与表达的问题
已经有14人回复
» 抢金币啦！回帖就可以得到:
-
2007年一起玩耍的老虫子们，想死你们啦~~~出来冒个泡吧……
+2/188
-
★★热帖★★上岸倒计时0860生物与医药-河北大学化学与材料科学学院祝你成功上岸！
+2/160
-
★★爆★★0860生物与医药调剂考生看过来，河北大学化学与材料科学学院
+2/152
-
物理学 调剂
+1/87
-
物理学调剂
+1/86
-
中科院新疆理化所诚聘能源电化学方向博士后、博士和科研助理启事
+1/84
-
浙师大化与材学院2026年有大量硕士研究生调剂名额 （线上 调剂）
+1/41
-
上海应用技术大学招收化学、物理、材料类调剂生
+1/40
-
研究生调剂招生（44名）
+1/38
-
广东石油化工学院刘诗咏教授团队化学化工、材料科学等方向尚有调剂名额
+1/37
-
南华大学招收调剂生，[085700]资源与环境—环境工程方向
+1/11
-
广州大学大湾区环境研究院环境大分子材料研究所王平山教授团队 2026年研究生招生简章
+1/11
-
招聘二次电池方向博士
+1/7
-
吉林工程技术师范学院 交叉学科研究院（08/07） 招收调剂
+1/6
-
齐齐哈尔大学李莉课题组诚招2026级考研调剂生（学硕和专硕）
+1/5
-
山西大学招收2026级申请考核制化学材料类博士研究生一名
+1/5
-
湖南大学白玉罡课题组招收2026年入学博士生（第二批补录）
+1/4
-
哈尔滨林业机械研究所吴老师方向收调剂学生，要求08学硕 四级国家线。
+1/4
-
考研调剂
+1/2
-
基于质谱从头测序与蛋白语言模型的肿瘤新抗原识别新技术研发 （杭州)
+1/2
15楼2012-05-19 07:47:24
★
wcx蜗牛(金币+1): 谢谢参与
wcx蜗牛(金币+1): 谢谢参与
|
本帖内容被屏蔽 |
2楼2012-05-18 20:24:45
7楼2012-05-18 21:11:02
★ ★ ★ ★ ★ ★
wcx蜗牛(金币+1): 谢谢参与
wcx蜗牛: 金币+3 2012-05-19 10:15:44
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-20 09:09:18
wcx蜗牛(金币+1): 谢谢参与
wcx蜗牛: 金币+3 2012-05-19 10:15:44
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-20 09:09:18
|
[1]不知道你的载体是只能通过抗生素筛选，还是具有蓝白斑筛选的区域，如果是后者，可以考虑用抗生素和蓝白斑筛选两个同时进行，例如T-载体就是需要这样的标准操作。 [2]未酶切的质粒电泳上可能出现三条带：超螺旋，标准，线性 不知道你是如何确定你的质粒是少了1000-2000bp [3]酶的厂家很重要，你用的那家公司的PFU？我个人觉的高保真酶FERMANTAS的HS PREMIE 很不错，当然实验室有银子，全上NEB的酶，那就更好了。。。 |
8楼2012-05-18 22:14:56
12楼2012-05-19 00:03:57
16楼2012-05-19 10:13:17
17楼2012-05-19 10:35:56
18楼2012-05-19 14:03:47
★ ★ ★
西瓜: 金币+3, Good！ 2012-05-20 18:42:55
西瓜: 金币+3, Good！ 2012-05-20 18:42:55
|
"我是用的T载体，只用了Amp抗生素筛选，实验室说蓝白筛选假阳性太多。我没有确定我的质粒少了1000-2000bp，是我挑去单克隆提质粒后发现，大部分都比我的空载要小，有的甚至要小1000-2000bp，有的只小一点点。实验室PFU不是很好，是北京索莱宝的，用TAQ可以而pfu不行，可能与酶有关。 用T载体连接后酶切发现由我的目的片段，可送去测序后测序结果显示是双峰，网上查询说T载体中连接片段有正向和反向，不知你有没有遇到过此种情况。谢谢" [1]其实T-载体连接用不用蓝白斑没有太大影响的（我们隔壁的实验室一直用蓝白斑 ，他们跟我说假阳性不是很多，只要运气不是背到家，挑个5个之内，都会有正常克隆的），因为正常情况下假阳性会非常少，除非你的片段特别长，例如超过T-载体的载样量什么的。 [2]T载体的确是有正向和反向。这个分两种情况 1）如果你的片段700bp左右，一个单向测序就可以解决，你得到结果后，跟你的目的片段进行对比，因为正反向的问题，你需要将对比序列正向对比下，再反向互补下，再对比下，来确定。 2）如果你的片段大于1000bp，这意味着你要双向测序，还要拼接，建议你找个标准，比较说启动子，或者酶切位点的位置作为标记，正，反向对比时 好寻找。 |
19楼2012-05-19 14:09:42
★
wcx蜗牛(金币+1): 谢谢参与
wcx蜗牛(金币+1): 谢谢参与
|
确保双酶切时的两个酶都完全酶切很重要。 而且请注意，不同的酶切相同的质粒所需的酶量是不同的。因而别人的酶切经验对你的酶切实验可能没有太多的帮助。 关于双酶切设计，我觉得你可以尝试用double digestion designer计算你的双酶切所需的精确酶量，不用猜测酶是否够多，而且切1个小时完全足够了，一般不需要延长时间。具体网址是http://www.bioinfomatics.cn/enzyme/login.php 祝一切顺利。 |
20楼2012-05-20 08:35:52
21楼2012-05-20 10:16:19
22楼2012-05-20 16:29:03
23楼2012-05-21 15:02:01
简单回复
2012-05-18 20:36
回复
wcx蜗牛(金币+1): 谢谢参与
2012-05-18 20:36
回复
2012-05-18 20:50
回复
wcx蜗牛(金币+1): 谢谢参与
2012-05-18 20:53
回复
wcx蜗牛(金币+1): 谢谢参与
cilinxue9楼
2012-05-18 22:26
回复
wcx蜗牛(金币+1): 谢谢参与
支持下
yanhj010楼
2012-05-18 22:45
回复
wcx蜗牛(金币+1): 谢谢参与
奋力拼搏11楼
2012-05-18 23:44
回复
wcx蜗牛(金币+1): 谢谢参与
foreve13楼
2012-05-19 00:10
回复
wcx蜗牛(金币+1): 谢谢参与
覃理梅sbejcf14楼
2012-05-19 00:17
回复
wcx蜗牛(金币+1): 谢谢参与
