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wcx蜗牛

无虫 (小有名气)


[交流] 质粒构建疑难杂症

本人近期构建质粒碰到一些问题在这里想很大家一起讨论:
1:载体和目的片段酶切,回收后连接转化提质粒后回发现有很多空载,我想其可能原因之一是载体发生了单酶切,其二载体没有切开。可是我是过夜酶切应该能是切开的,若果载体没有切开那么在切胶回收时也是可以分开的,有点疑惑。 对于转化后的空载问题各位是怎样避免的。
2:近期转化后提质粒发现很多质粒比空载小1000-2000bp,有的也比空载小点,出现这种情况有点疑惑了。我酶是用ECOR1和XHO1。
3:我pcr目的基因由TAQ酶可以很好扩增出来,可PFU始终不可以,不知大家有没有什么提高TAQ酶保真性的方法。
4;大家认为在克隆基因方面的一些关键点。
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张宏宇123

金虫 (著名写手)


★ ★ ★
wcx蜗牛(金币+1): 谢谢参与
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-20 09:09:09
1.你载体双酶切,如果其中有一个酶酶切效率不高的话,很可能你载体大部分都是单酶切,如果在多克隆位点上的话,单酶切和双酶切很难看出来,你载体处理完连接的时候可以做一个阴性对照,看看你载体处理的怎么样。
2.你载体是多大的?有比载体还小的可能是你载体断了。
7楼2012-05-18 21:11:02
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叶倾意

金虫 (小有名气)


★ ★ ★ ★ ★ ★
wcx蜗牛(金币+1): 谢谢参与
wcx蜗牛: 金币+3 2012-05-19 10:15:44
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-20 09:09:18
[1]不知道你的载体是只能通过抗生素筛选,还是具有蓝白斑筛选的区域,如果是后者,可以考虑用抗生素和蓝白斑筛选两个同时进行,例如T-载体就是需要这样的标准操作。
[2]未酶切的质粒电泳上可能出现三条带:超螺旋,标准,线性
不知道你是如何确定你的质粒是少了1000-2000bp
[3]酶的厂家很重要,你用的那家公司的PFU?我个人觉的高保真酶FERMANTAS的HS PREMIE 很不错,当然实验室有银子,全上NEB的酶,那就更好了。。。
8楼2012-05-18 22:14:56
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8673929493楼
2012-05-18 20:36   回复  
wcx蜗牛(金币+1): 谢谢参与
引用回帖:
2楼: Originally posted by liushuyan at 2012-05-18 20:24:45: 3:太长了?

8673929494楼
2012-05-18 20:36   回复  
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