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[交流]
质粒构建疑难杂症
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本人近期构建质粒碰到一些问题在这里想很大家一起讨论： 1：载体和目的片段酶切，回收后连接转化提质粒后回发现有很多空载，我想其可能原因之一是载体发生了单酶切，其二载体没有切开。可是我是过夜酶切应该能是切开的，若果载体没有切开那么在切胶回收时也是可以分开的，有点疑惑。 对于转化后的空载问题各位是怎样避免的。 2：近期转化后提质粒发现很多质粒比空载小1000-2000bp,有的也比空载小点，出现这种情况有点疑惑了。我酶是用ECOR1和XHO1。 3：我pcr目的基因由TAQ酶可以很好扩增出来，可PFU始终不可以，不知大家有没有什么提高TAQ酶保真性的方法。 4;大家认为在克隆基因方面的一些关键点。 |
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15楼2012-05-19 07:47:24
★
wcx蜗牛(金币+1): 谢谢参与
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本帖内容被屏蔽 |
2楼2012-05-18 20:24:45
7楼2012-05-18 21:11:02
★ ★ ★ ★ ★ ★
wcx蜗牛(金币+1): 谢谢参与
wcx蜗牛: 金币+3 2012-05-19 10:15:44
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-20 09:09:18
wcx蜗牛(金币+1): 谢谢参与
wcx蜗牛: 金币+3 2012-05-19 10:15:44
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-20 09:09:18
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[1]不知道你的载体是只能通过抗生素筛选，还是具有蓝白斑筛选的区域，如果是后者，可以考虑用抗生素和蓝白斑筛选两个同时进行，例如T-载体就是需要这样的标准操作。 [2]未酶切的质粒电泳上可能出现三条带：超螺旋，标准，线性 不知道你是如何确定你的质粒是少了1000-2000bp [3]酶的厂家很重要，你用的那家公司的PFU？我个人觉的高保真酶FERMANTAS的HS PREMIE 很不错，当然实验室有银子，全上NEB的酶，那就更好了。。。 |
8楼2012-05-18 22:14:56
12楼2012-05-19 00:03:57
16楼2012-05-19 10:13:17
17楼2012-05-19 10:35:56
18楼2012-05-19 14:03:47
★ ★ ★
西瓜: 金币+3, Good！ 2012-05-20 18:42:55
西瓜: 金币+3, Good！ 2012-05-20 18:42:55
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"我是用的T载体，只用了Amp抗生素筛选，实验室说蓝白筛选假阳性太多。我没有确定我的质粒少了1000-2000bp，是我挑去单克隆提质粒后发现，大部分都比我的空载要小，有的甚至要小1000-2000bp，有的只小一点点。实验室PFU不是很好，是北京索莱宝的，用TAQ可以而pfu不行，可能与酶有关。 用T载体连接后酶切发现由我的目的片段，可送去测序后测序结果显示是双峰，网上查询说T载体中连接片段有正向和反向，不知你有没有遇到过此种情况。谢谢" [1]其实T-载体连接用不用蓝白斑没有太大影响的（我们隔壁的实验室一直用蓝白斑 ，他们跟我说假阳性不是很多，只要运气不是背到家，挑个5个之内，都会有正常克隆的），因为正常情况下假阳性会非常少，除非你的片段特别长，例如超过T-载体的载样量什么的。 [2]T载体的确是有正向和反向。这个分两种情况 1）如果你的片段700bp左右，一个单向测序就可以解决，你得到结果后，跟你的目的片段进行对比，因为正反向的问题，你需要将对比序列正向对比下，再反向互补下，再对比下，来确定。 2）如果你的片段大于1000bp，这意味着你要双向测序，还要拼接，建议你找个标准，比较说启动子，或者酶切位点的位置作为标记，正，反向对比时 好寻找。 |
19楼2012-05-19 14:09:42
★
wcx蜗牛(金币+1): 谢谢参与
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确保双酶切时的两个酶都完全酶切很重要。 而且请注意，不同的酶切相同的质粒所需的酶量是不同的。因而别人的酶切经验对你的酶切实验可能没有太多的帮助。 关于双酶切设计，我觉得你可以尝试用double digestion designer计算你的双酶切所需的精确酶量，不用猜测酶是否够多，而且切1个小时完全足够了，一般不需要延长时间。具体网址是http://www.bioinfomatics.cn/enzyme/login.php 祝一切顺利。 |
20楼2012-05-20 08:35:52
21楼2012-05-20 10:16:19
22楼2012-05-20 16:29:03
23楼2012-05-21 15:02:01
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2012-05-18 20:36
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wcx蜗牛(金币+1): 谢谢参与
2012-05-18 20:36
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2012-05-18 20:50
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2012-05-18 20:53
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cilinxue9楼
2012-05-18 22:26
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支持下
yanhj010楼
2012-05-18 22:45
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奋力拼搏11楼
2012-05-18 23:44
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foreve13楼
2012-05-19 00:10
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覃理梅sbejcf14楼
2012-05-19 00:17
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