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[交流]
质粒构建疑难杂症
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本人近期构建质粒碰到一些问题在这里想很大家一起讨论: 1:载体和目的片段酶切,回收后连接转化提质粒后回发现有很多空载,我想其可能原因之一是载体发生了单酶切,其二载体没有切开。可是我是过夜酶切应该能是切开的,若果载体没有切开那么在切胶回收时也是可以分开的,有点疑惑。 对于转化后的空载问题各位是怎样避免的。 2:近期转化后提质粒发现很多质粒比空载小1000-2000bp,有的也比空载小点,出现这种情况有点疑惑了。我酶是用ECOR1和XHO1。 3:我pcr目的基因由TAQ酶可以很好扩增出来,可PFU始终不可以,不知大家有没有什么提高TAQ酶保真性的方法。 4;大家认为在克隆基因方面的一些关键点。 |
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15楼2012-05-19 07:47:24
★
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2楼2012-05-18 20:24:45
7楼2012-05-18 21:11:02
★ ★ ★ ★ ★ ★
wcx蜗牛(金币+1): 谢谢参与
wcx蜗牛: 金币+3 2012-05-19 10:15:44
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-20 09:09:18
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小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-20 09:09:18
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[1]不知道你的载体是只能通过抗生素筛选,还是具有蓝白斑筛选的区域,如果是后者,可以考虑用抗生素和蓝白斑筛选两个同时进行,例如T-载体就是需要这样的标准操作。 [2]未酶切的质粒电泳上可能出现三条带:超螺旋,标准,线性 不知道你是如何确定你的质粒是少了1000-2000bp [3]酶的厂家很重要,你用的那家公司的PFU?我个人觉的高保真酶FERMANTAS的HS PREMIE 很不错,当然实验室有银子,全上NEB的酶,那就更好了。。。 |
8楼2012-05-18 22:14:56
12楼2012-05-19 00:03:57
16楼2012-05-19 10:13:17
17楼2012-05-19 10:35:56
18楼2012-05-19 14:03:47
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西瓜: 金币+3, Good! 2012-05-20 18:42:55
西瓜: 金币+3, Good! 2012-05-20 18:42:55
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"我是用的T载体,只用了Amp抗生素筛选,实验室说蓝白筛选假阳性太多。我没有确定我的质粒少了1000-2000bp,是我挑去单克隆提质粒后发现,大部分都比我的空载要小,有的甚至要小1000-2000bp,有的只小一点点。实验室PFU不是很好,是北京索莱宝的,用TAQ可以而pfu不行,可能与酶有关。 用T载体连接后酶切发现由我的目的片段,可送去测序后测序结果显示是双峰,网上查询说T载体中连接片段有正向和反向,不知你有没有遇到过此种情况。谢谢" [1]其实T-载体连接用不用蓝白斑没有太大影响的(我们隔壁的实验室一直用蓝白斑 ,他们跟我说假阳性不是很多,只要运气不是背到家,挑个5个之内,都会有正常克隆的),因为正常情况下假阳性会非常少,除非你的片段特别长,例如超过T-载体的载样量什么的。 [2]T载体的确是有正向和反向。这个分两种情况 1)如果你的片段700bp左右,一个单向测序就可以解决,你得到结果后,跟你的目的片段进行对比,因为正反向的问题,你需要将对比序列正向对比下,再反向互补下,再对比下,来确定。 2)如果你的片段大于1000bp,这意味着你要双向测序,还要拼接,建议你找个标准,比较说启动子,或者酶切位点的位置作为标记,正,反向对比时 好寻找。 |
19楼2012-05-19 14:09:42
★
wcx蜗牛(金币+1): 谢谢参与
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确保双酶切时的两个酶都完全酶切很重要。 而且请注意,不同的酶切相同的质粒所需的酶量是不同的。因而别人的酶切经验对你的酶切实验可能没有太多的帮助。 关于双酶切设计,我觉得你可以尝试用double digestion designer计算你的双酶切所需的精确酶量,不用猜测酶是否够多,而且切1个小时完全足够了,一般不需要延长时间。具体网址是http://www.bioinfomatics.cn/enzyme/login.php 祝一切顺利。 |
20楼2012-05-20 08:35:52
21楼2012-05-20 10:16:19
22楼2012-05-20 16:29:03
23楼2012-05-21 15:02:01
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2012-05-18 20:36
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2012-05-18 20:36
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2012-05-18 20:50
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2012-05-18 20:53
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cilinxue9楼
2012-05-18 22:26
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yanhj010楼
2012-05-18 22:45
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foreve13楼
2012-05-19 00:10
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2012-05-19 00:17
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