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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 质粒构建疑难杂症
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wcx蜗牛

无虫 (小有名气)

[交流] 质粒构建疑难杂症

本人近期构建质粒碰到一些问题在这里想很大家一起讨论：
1：载体和目的片段酶切，回收后连接转化提质粒后回发现有很多空载，我想其可能原因之一是载体发生了单酶切，其二载体没有切开。可是我是过夜酶切应该能是切开的，若果载体没有切开那么在切胶回收时也是可以分开的，有点疑惑。 对于转化后的空载问题各位是怎样避免的。
2：近期转化后提质粒发现很多质粒比空载小1000-2000bp,有的也比空载小点，出现这种情况有点疑惑了。我酶是用ECOR1和XHO1。
3：我pcr目的基因由TAQ酶可以很好扩增出来，可PFU始终不可以，不知大家有没有什么提高TAQ酶保真性的方法。
4;大家认为在克隆基因方面的一些关键点。
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1楼 2012-05-18 19:47:53
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wcx蜗牛

无虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 叶倾意 at 2012-05-18 22:14:56:
不知道你的载体是只能通过抗生素筛选，还是具有蓝白斑筛选的区域，如果是后者，可以考虑用抗生素和蓝白斑筛选两个同时进行，例如T-载体就是需要这样的标准操作。
未酶切的质粒电泳上可能出现三条带：超螺旋，标准 ...

我是用的T载体，只用了Amp抗生素筛选，实验室说蓝白筛选假阳性太多。我没有确定我的质粒少了1000-2000bp，是我挑去单克隆提质粒后发现，大部分都比我的空载要小，有的甚至要小1000-2000bp，有的只小一点点。实验室PFU不是很好，是北京索莱宝的，用TAQ可以而pfu不行，可能与酶有关。
用T载体连接后酶切发现由我的目的片段，可送去测序后测序结果显示是双峰，网上查询说T载体中连接片段有正向和反向，不知你有没有遇到过此种情况。谢谢
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17楼2012-05-19 10:35:56
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wcx蜗牛

无虫 (小有名气)
引用回帖:
19楼: Originally posted by 叶倾意 at 2012-05-19 14:09:42:
"我是用的T载体，只用了Amp抗生素筛选，实验室说蓝白筛选假阳性太多。我没有确定我的质粒少了1000-2000bp，是我挑去单克隆提质粒后发现，大部分都比我的空载要小，有的甚至要小1000-2000bp，有的只小一点点 ...

我目的片段1.7Kb，是双向测序，今天我拿到的全部测序结果显示全部都是双峰，没有办法比对，我想问怎样可以从正向和反向中筛选出只含有正向或反向质粒的菌株。同时还有一个疑问双酶切后出现我的目的片段，可是酶切后T载稍微有点偏大。T载体大约是2.6Kb,酶切后电泳，显示大约在2.8左右，不知是什么问题。
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22楼2012-05-20 16:29:03
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wqf8811

铜虫 (小有名气)
★ ★
wcx蜗牛(金币+1): 谢谢参与
西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-05-20 18:40:56
我们实验室也出现过类似的情况，我们解决的办法是将双酶切分两次进行先让一个酶切8h，然后加第二种酶再切8h，一切就OK了
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15楼2012-05-19 07:47:24
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普通回帖

liushuyan

禁虫 (知名作家)
★
wcx蜗牛(金币+1): 谢谢参与
本帖内容被屏蔽
2楼2012-05-18 20:24:45
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张宏宇123

金虫 (著名写手)
★ ★ ★
wcx蜗牛(金币+1): 谢谢参与
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-20 09:09:09
1.你载体双酶切，如果其中有一个酶酶切效率不高的话，很可能你载体大部分都是单酶切，如果在多克隆位点上的话，单酶切和双酶切很难看出来，你载体处理完连接的时候可以做一个阴性对照，看看你载体处理的怎么样。
2．你载体是多大的？有比载体还小的可能是你载体断了。
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7楼2012-05-18 21:11:02
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叶倾意

金虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★ ★
wcx蜗牛(金币+1): 谢谢参与
wcx蜗牛: 金币+3 2012-05-19 10:15:44
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-20 09:09:18
[1]不知道你的载体是只能通过抗生素筛选，还是具有蓝白斑筛选的区域，如果是后者，可以考虑用抗生素和蓝白斑筛选两个同时进行，例如T-载体就是需要这样的标准操作。
[2]未酶切的质粒电泳上可能出现三条带：超螺旋，标准，线性
不知道你是如何确定你的质粒是少了1000-2000bp
[3]酶的厂家很重要，你用的那家公司的PFU？我个人觉的高保真酶FERMANTAS的HS PREMIE 很不错，当然实验室有银子，全上NEB的酶，那就更好了。。。
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8楼2012-05-18 22:14:56
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sosako

金虫 (著名写手)
★
wcx蜗牛(金币+1): 谢谢参与
太复杂论文
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12楼2012-05-19 00:03:57
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wcx蜗牛

无虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 张宏宇123 at 2012-05-18 21:11:02:
1.你载体双酶切，如果其中有一个酶酶切效率不高的话，很可能你载体大部分都是单酶切，如果在多克隆位点上的话，单酶切和双酶切很难看出来，你载体处理完连接的时候可以做一个阴性对照，看看你载体处理的怎么样。
...

载体是pCDNA3.1和pED22B,大概都是5.5Kb
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16楼2012-05-19 10:13:17
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爱莫若月

木虫 (小有名气)
★
wcx蜗牛(金币+1): 谢谢参与
近期我也遇到同样的问题~还得多学学啊
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18楼2012-05-19 14:03:47
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叶倾意

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
西瓜: 金币+3, Good！ 2012-05-20 18:42:55
引用回帖:
17楼: Originally posted by wcx蜗牛 at 2012-05-19 10:35:56:
我是用的T载体，只用了Amp抗生素筛选，实验室说蓝白筛选假阳性太多。我没有确定我的质粒少了1000-2000bp，是我挑去单克隆提质粒后发现，大部分都比我的空载要小，有的甚至要小1000-2000bp，有的只小一点点。实验 ...

"我是用的T载体，只用了Amp抗生素筛选，实验室说蓝白筛选假阳性太多。我没有确定我的质粒少了1000-2000bp，是我挑去单克隆提质粒后发现，大部分都比我的空载要小，有的甚至要小1000-2000bp，有的只小一点点。实验室PFU不是很好，是北京索莱宝的，用TAQ可以而pfu不行，可能与酶有关。
用T载体连接后酶切发现由我的目的片段，可送去测序后测序结果显示是双峰，网上查询说T载体中连接片段有正向和反向，不知你有没有遇到过此种情况。谢谢"

[1]其实T-载体连接用不用蓝白斑没有太大影响的（我们隔壁的实验室一直用蓝白斑 ，他们跟我说假阳性不是很多，只要运气不是背到家，挑个5个之内，都会有正常克隆的），因为正常情况下假阳性会非常少，除非你的片段特别长，例如超过T-载体的载样量什么的。
[2]T载体的确是有正向和反向。这个分两种情况
1）如果你的片段700bp左右，一个单向测序就可以解决，你得到结果后，跟你的目的片段进行对比，因为正反向的问题，你需要将对比序列正向对比下，再反向互补下，再对比下，来确定。
2）如果你的片段大于1000bp，这意味着你要双向测序，还要拼接，建议你找个标准，比较说启动子，或者酶切位点的位置作为标记，正，反向对比时 好寻找。
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19楼2012-05-19 14:09:42
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酶切专家

金虫 (小有名气)
★
wcx蜗牛(金币+1): 谢谢参与
确保双酶切时的两个酶都完全酶切很重要。
而且请注意，不同的酶切相同的质粒所需的酶量是不同的。因而别人的酶切经验对你的酶切实验可能没有太多的帮助。
关于双酶切设计，我觉得你可以尝试用double digestion designer计算你的双酶切所需的精确酶量，不用猜测酶是否够多，而且切1个小时完全足够了，一般不需要延长时间。具体网址是http://www.bioinfomatics.cn/enzyme/login.php
祝一切顺利。
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20楼2012-05-20 08:35:52
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无踪无影

金虫 (小有名气)
★
wcx蜗牛(金币+1): 谢谢参与
引用回帖:
17楼: Originally posted by wcx蜗牛 at 2012-05-19 10:35:56:
我是用的T载体，只用了Amp抗生素筛选，实验室说蓝白筛选假阳性太多。我没有确定我的质粒少了1000-2000bp，是我挑去单克隆提质粒后发现，大部分都比我的空载要小，有的甚至要小1000-2000bp，有的只小一点点。实验 ...

我的T载体送出去测序也说的是显示双峰，不知道是怎么回事
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21楼2012-05-20 10:16:19
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早冰124

新虫 (初入文坛)
★
wcx蜗牛(金币+1): 谢谢参与
我用的高保真酶是fermentas公司的High fidelity PCR enzyme MIX,只有酶和buffer需要自己加dNTP,要看自己提的质粒片段大小是多了还是少了要经过单酶切处理看看的，光提质粒跑电泳是看不出多了还是少了的，只有都是线性的质粒才能比较大小，
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23楼2012-05-21 15:02:01
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8673929493楼
2012-05-18 20:36   回复  
wcx蜗牛(金币+1): 谢谢参与
引用回帖:
2楼: Originally posted by liushuyan at 2012-05-18 20:24:45: 3：太长了？

8673929494楼
2012-05-18 20:36   回复  
tsh8902135楼
2012-05-18 20:50   回复  
wcx蜗牛(金币+1): 谢谢参与
Ling1989806楼
2012-05-18 20:53   回复  
wcx蜗牛(金币+1): 谢谢参与
cilinxue9楼
2012-05-18 22:26   回复  
wcx蜗牛(金币+1): 谢谢参与
支持下
yanhj010楼
2012-05-18 22:45   回复  
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奋力拼搏11楼
2012-05-18 23:44   回复  
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foreve13楼
2012-05-19 00:10   回复  
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覃理梅sbejcf14楼
2012-05-19 00:17   回复  
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