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质粒构建疑难杂症
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本人近期构建质粒碰到一些问题在这里想很大家一起讨论： 1：载体和目的片段酶切，回收后连接转化提质粒后回发现有很多空载，我想其可能原因之一是载体发生了单酶切，其二载体没有切开。可是我是过夜酶切应该能是切开的，若果载体没有切开那么在切胶回收时也是可以分开的，有点疑惑。 对于转化后的空载问题各位是怎样避免的。 2：近期转化后提质粒发现很多质粒比空载小1000-2000bp,有的也比空载小点，出现这种情况有点疑惑了。我酶是用ECOR1和XHO1。 3：我pcr目的基因由TAQ酶可以很好扩增出来，可PFU始终不可以，不知大家有没有什么提高TAQ酶保真性的方法。 4;大家认为在克隆基因方面的一些关键点。 |
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wcx蜗牛(金币+1): 谢谢参与
wcx蜗牛: 金币+3 2012-05-19 10:15:44
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-20 09:09:18
wcx蜗牛(金币+1): 谢谢参与
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小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-20 09:09:18
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[1]不知道你的载体是只能通过抗生素筛选，还是具有蓝白斑筛选的区域，如果是后者，可以考虑用抗生素和蓝白斑筛选两个同时进行，例如T-载体就是需要这样的标准操作。 [2]未酶切的质粒电泳上可能出现三条带：超螺旋，标准，线性 不知道你是如何确定你的质粒是少了1000-2000bp [3]酶的厂家很重要，你用的那家公司的PFU？我个人觉的高保真酶FERMANTAS的HS PREMIE 很不错，当然实验室有银子，全上NEB的酶，那就更好了。。。 |
8楼2012-05-18 22:14:56
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2012-05-18 20:36
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wcx蜗牛(金币+1): 谢谢参与
2012-05-18 20:36
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