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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 质粒构建疑难杂症
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wcx蜗牛

无虫 (小有名气)

[交流] 质粒构建疑难杂症

本人近期构建质粒碰到一些问题在这里想很大家一起讨论：
1：载体和目的片段酶切，回收后连接转化提质粒后回发现有很多空载，我想其可能原因之一是载体发生了单酶切，其二载体没有切开。可是我是过夜酶切应该能是切开的，若果载体没有切开那么在切胶回收时也是可以分开的，有点疑惑。 对于转化后的空载问题各位是怎样避免的。
2：近期转化后提质粒发现很多质粒比空载小1000-2000bp,有的也比空载小点，出现这种情况有点疑惑了。我酶是用ECOR1和XHO1。
3：我pcr目的基因由TAQ酶可以很好扩增出来，可PFU始终不可以，不知大家有没有什么提高TAQ酶保真性的方法。
4;大家认为在克隆基因方面的一些关键点。
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1楼2012-05-18 19:47:53
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wcx蜗牛

无虫 (小有名气)
引用回帖:
19楼: Originally posted by 叶倾意 at 2012-05-19 14:09:42:
"我是用的T载体，只用了Amp抗生素筛选，实验室说蓝白筛选假阳性太多。我没有确定我的质粒少了1000-2000bp，是我挑去单克隆提质粒后发现，大部分都比我的空载要小，有的甚至要小1000-2000bp，有的只小一点点 ...

我目的片段1.7Kb，是双向测序，今天我拿到的全部测序结果显示全部都是双峰，没有办法比对，我想问怎样可以从正向和反向中筛选出只含有正向或反向质粒的菌株。同时还有一个疑问双酶切后出现我的目的片段，可是酶切后T载稍微有点偏大。T载体大约是2.6Kb,酶切后电泳，显示大约在2.8左右，不知是什么问题。
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22楼2012-05-20 16:29:03
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张宏宇123

金虫 (著名写手)
★ ★ ★
wcx蜗牛(金币+1): 谢谢参与
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-20 09:09:09
1.你载体双酶切，如果其中有一个酶酶切效率不高的话，很可能你载体大部分都是单酶切，如果在多克隆位点上的话，单酶切和双酶切很难看出来，你载体处理完连接的时候可以做一个阴性对照，看看你载体处理的怎么样。
2．你载体是多大的？有比载体还小的可能是你载体断了。
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7楼2012-05-18 21:11:02
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叶倾意

金虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★ ★
wcx蜗牛(金币+1): 谢谢参与
wcx蜗牛: 金币+3 2012-05-19 10:15:44
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-20 09:09:18
[1]不知道你的载体是只能通过抗生素筛选，还是具有蓝白斑筛选的区域，如果是后者，可以考虑用抗生素和蓝白斑筛选两个同时进行，例如T-载体就是需要这样的标准操作。
[2]未酶切的质粒电泳上可能出现三条带：超螺旋，标准，线性
不知道你是如何确定你的质粒是少了1000-2000bp
[3]酶的厂家很重要，你用的那家公司的PFU？我个人觉的高保真酶FERMANTAS的HS PREMIE 很不错，当然实验室有银子，全上NEB的酶，那就更好了。。。
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8楼2012-05-18 22:14:56
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8673929493楼
2012-05-18 20:36   回复  
wcx蜗牛(金币+1): 谢谢参与
引用回帖:
2楼: Originally posted by liushuyan at 2012-05-18 20:24:45: 3：太长了？

8673929494楼
2012-05-18 20:36   回复  
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