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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 质粒构建疑难杂症
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wcx蜗牛

无虫 (小有名气)

[交流] 质粒构建疑难杂症

本人近期构建质粒碰到一些问题在这里想很大家一起讨论：
1：载体和目的片段酶切，回收后连接转化提质粒后回发现有很多空载，我想其可能原因之一是载体发生了单酶切，其二载体没有切开。可是我是过夜酶切应该能是切开的，若果载体没有切开那么在切胶回收时也是可以分开的，有点疑惑。 对于转化后的空载问题各位是怎样避免的。
2：近期转化后提质粒发现很多质粒比空载小1000-2000bp,有的也比空载小点，出现这种情况有点疑惑了。我酶是用ECOR1和XHO1。
3：我pcr目的基因由TAQ酶可以很好扩增出来，可PFU始终不可以，不知大家有没有什么提高TAQ酶保真性的方法。
4;大家认为在克隆基因方面的一些关键点。
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1楼 2012-05-18 19:47:53
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酶切专家

金虫 (小有名气)
★
wcx蜗牛(金币+1): 谢谢参与
确保双酶切时的两个酶都完全酶切很重要。
而且请注意，不同的酶切相同的质粒所需的酶量是不同的。因而别人的酶切经验对你的酶切实验可能没有太多的帮助。
关于双酶切设计，我觉得你可以尝试用double digestion designer计算你的双酶切所需的精确酶量，不用猜测酶是否够多，而且切1个小时完全足够了，一般不需要延长时间。具体网址是http://www.bioinfomatics.cn/enzyme/login.php
祝一切顺利。
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20楼2012-05-20 08:35:52
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张宏宇123

金虫 (著名写手)
★ ★ ★
wcx蜗牛(金币+1): 谢谢参与
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-20 09:09:09
1.你载体双酶切，如果其中有一个酶酶切效率不高的话，很可能你载体大部分都是单酶切，如果在多克隆位点上的话，单酶切和双酶切很难看出来，你载体处理完连接的时候可以做一个阴性对照，看看你载体处理的怎么样。
2．你载体是多大的？有比载体还小的可能是你载体断了。
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7楼2012-05-18 21:11:02
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叶倾意

金虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★ ★
wcx蜗牛(金币+1): 谢谢参与
wcx蜗牛: 金币+3 2012-05-19 10:15:44
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-20 09:09:18
[1]不知道你的载体是只能通过抗生素筛选，还是具有蓝白斑筛选的区域，如果是后者，可以考虑用抗生素和蓝白斑筛选两个同时进行，例如T-载体就是需要这样的标准操作。
[2]未酶切的质粒电泳上可能出现三条带：超螺旋，标准，线性
不知道你是如何确定你的质粒是少了1000-2000bp
[3]酶的厂家很重要，你用的那家公司的PFU？我个人觉的高保真酶FERMANTAS的HS PREMIE 很不错，当然实验室有银子，全上NEB的酶，那就更好了。。。
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8楼2012-05-18 22:14:56
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8673929493楼
2012-05-18 20:36   回复  
wcx蜗牛(金币+1): 谢谢参与
引用回帖:
2楼: Originally posted by liushuyan at 2012-05-18 20:24:45: 3：太长了？

8673929494楼
2012-05-18 20:36   回复  
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