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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 质粒构建疑难杂症
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wcx蜗牛

无虫 (小有名气)

[交流] 质粒构建疑难杂症

本人近期构建质粒碰到一些问题在这里想很大家一起讨论：
1：载体和目的片段酶切，回收后连接转化提质粒后回发现有很多空载，我想其可能原因之一是载体发生了单酶切，其二载体没有切开。可是我是过夜酶切应该能是切开的，若果载体没有切开那么在切胶回收时也是可以分开的，有点疑惑。 对于转化后的空载问题各位是怎样避免的。
2：近期转化后提质粒发现很多质粒比空载小1000-2000bp,有的也比空载小点，出现这种情况有点疑惑了。我酶是用ECOR1和XHO1。
3：我pcr目的基因由TAQ酶可以很好扩增出来，可PFU始终不可以，不知大家有没有什么提高TAQ酶保真性的方法。
4;大家认为在克隆基因方面的一些关键点。
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1楼2012-05-18 19:47:53
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叶倾意

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
西瓜: 金币+3, Good！ 2012-05-20 18:42:55
引用回帖:
17楼: Originally posted by wcx蜗牛 at 2012-05-19 10:35:56:
我是用的T载体，只用了Amp抗生素筛选，实验室说蓝白筛选假阳性太多。我没有确定我的质粒少了1000-2000bp，是我挑去单克隆提质粒后发现，大部分都比我的空载要小，有的甚至要小1000-2000bp，有的只小一点点。实验 ...

"我是用的T载体，只用了Amp抗生素筛选，实验室说蓝白筛选假阳性太多。我没有确定我的质粒少了1000-2000bp，是我挑去单克隆提质粒后发现，大部分都比我的空载要小，有的甚至要小1000-2000bp，有的只小一点点。实验室PFU不是很好，是北京索莱宝的，用TAQ可以而pfu不行，可能与酶有关。
用T载体连接后酶切发现由我的目的片段，可送去测序后测序结果显示是双峰，网上查询说T载体中连接片段有正向和反向，不知你有没有遇到过此种情况。谢谢"

[1]其实T-载体连接用不用蓝白斑没有太大影响的（我们隔壁的实验室一直用蓝白斑 ，他们跟我说假阳性不是很多，只要运气不是背到家，挑个5个之内，都会有正常克隆的），因为正常情况下假阳性会非常少，除非你的片段特别长，例如超过T-载体的载样量什么的。
[2]T载体的确是有正向和反向。这个分两种情况
1）如果你的片段700bp左右，一个单向测序就可以解决，你得到结果后，跟你的目的片段进行对比，因为正反向的问题，你需要将对比序列正向对比下，再反向互补下，再对比下，来确定。
2）如果你的片段大于1000bp，这意味着你要双向测序，还要拼接，建议你找个标准，比较说启动子，或者酶切位点的位置作为标记，正，反向对比时 好寻找。
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19楼2012-05-19 14:09:42
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张宏宇123

金虫 (著名写手)
★ ★ ★
wcx蜗牛(金币+1): 谢谢参与
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-20 09:09:09
1.你载体双酶切，如果其中有一个酶酶切效率不高的话，很可能你载体大部分都是单酶切，如果在多克隆位点上的话，单酶切和双酶切很难看出来，你载体处理完连接的时候可以做一个阴性对照，看看你载体处理的怎么样。
2．你载体是多大的？有比载体还小的可能是你载体断了。
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7楼2012-05-18 21:11:02
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叶倾意

金虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★ ★
wcx蜗牛(金币+1): 谢谢参与
wcx蜗牛: 金币+3 2012-05-19 10:15:44
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-20 09:09:18
[1]不知道你的载体是只能通过抗生素筛选，还是具有蓝白斑筛选的区域，如果是后者，可以考虑用抗生素和蓝白斑筛选两个同时进行，例如T-载体就是需要这样的标准操作。
[2]未酶切的质粒电泳上可能出现三条带：超螺旋，标准，线性
不知道你是如何确定你的质粒是少了1000-2000bp
[3]酶的厂家很重要，你用的那家公司的PFU？我个人觉的高保真酶FERMANTAS的HS PREMIE 很不错，当然实验室有银子，全上NEB的酶，那就更好了。。。
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8楼2012-05-18 22:14:56
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8673929493楼
2012-05-18 20:36   回复  
wcx蜗牛(金币+1): 谢谢参与
引用回帖:
2楼: Originally posted by liushuyan at 2012-05-18 20:24:45: 3：太长了？

8673929494楼
2012-05-18 20:36   回复  
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