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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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hucuiyao

新虫 (小有名气)

[交流] 菌液PCR问题 已有10人参与

我做菌液PCR，同学说出来的都是引物二聚体，这是怎么回事呢？
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yichongweiban
1楼 2012-05-09 15:02:31
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137167741

至尊木虫 (著名写手)
★ ★
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西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-05-09 19:11:41
要说明你为什么做菌液PCR，如果单纯是细菌基因组有该基因，即存在模板，PCR出来都是引物二具体，说明有可能引物不行，有可能是PCR操作有问题；若是连接载体，转化感受态细胞，检验是否有目的基因，可能是由于你转化失败，质粒没有转进去。
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总有一天我要修改用户名。
4楼2012-05-09 16:23:06
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xzx018

铁杆木虫 (著名写手)
★
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上图啊，引物二聚体都在最下面，我的都在100bp以下，在做菌液pcr时先把菌煮沸5min左右，使细胞裂解，当然也有人说预变性时也可以达到这个目的
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2楼2012-05-09 15:06:12
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超然渡陈

金虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
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西瓜: 金币+3, 鼓励交流 2012-05-09 19:11:47
楼主应该是用菌液PCR做快速鉴定转化后的阳性克隆吧？所用的引物是你之前克隆基因的引物，还是载体上的通用引物？要把具体情况说清楚而且最好要带图的。假如用的是克隆基因时的引物，做菌落PCR或者菌液PCR没有目的条带而出现引物二聚体可以大概说明是假阳性。要是用的通用引物或者其它新的引物，可能是你退火温度没选好或者其它一些原因，但是不能肯定是假阳性。另外需要说明的是做酵母菌落或者菌液PCR要提前煮沸，因为酵母有细胞壁，预变性和变性不能使壁完全破碎，而一般的细菌就不用预先煮沸。
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5楼2012-05-09 17:10:37
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hucuiyao

新虫 (小有名气)
我做菌液PCR是要鉴定转化后的阳性克隆，用的是通用引物，是转化大肠杆菌的，94度预变性4分钟，94度45秒，50度45秒，72度1分30秒，31个偱环，长度大约是1200bp的。这个程序大家认为合适吗？这个预变性时间是不是短了点？退火温度不知道是不是也低呢？请各位虫友帮忙分析下，图片当时看的没目的条带，所以也没保存，初做没经验，不好意思噢
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yichongweiban
6楼2012-05-10 15:59:54
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