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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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hucuiyao

新虫 (小有名气)

[交流] 菌液PCR问题 已有10人参与

我做菌液PCR,同学说出来的都是引物二聚体,这是怎么回事呢?
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yichongweiban
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超然渡陈

金虫 (小有名气)

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西瓜: 金币+3, 鼓励交流 2012-05-09 19:11:47
楼主应该是用菌液PCR做快速鉴定转化后的阳性克隆吧?所用的引物是你之前克隆基因的引物,还是载体上的通用引物?要把具体情况说清楚而且最好要带图的。假如用的是克隆基因时的引物,做菌落PCR或者菌液PCR没有目的条带而出现引物二聚体可以大概说明是假阳性。要是用的通用引物或者其它新的引物,可能是你退火温度没选好或者其它一些原因,但是不能肯定是假阳性。另外需要说明的是做酵母菌落或者菌液PCR要提前煮沸,因为酵母有细胞壁,预变性和变性不能使壁完全破碎,而一般的细菌就不用预先煮沸。
5楼2012-05-09 17:10:37
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xzx018

铁杆木虫 (著名写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
上图啊,引物二聚体都在最下面,我的都在100bp以下,在做菌液pcr时先把菌煮沸5min左右,使细胞裂解,当然也有人说预变性时也可以达到这个目的
2楼2012-05-09 15:06:12
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137167741

至尊木虫 (著名写手)

★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-05-09 19:11:41
要说明你为什么做菌液PCR,如果单纯是细菌基因组有该基因,即存在模板,PCR出来都是引物二具体,说明有可能引物不行,有可能是PCR操作有问题;若是连接载体,转化感受态细胞,检验是否有目的基因,可能是由于你转化失败,质粒没有转进去。
总有一天我要修改用户名。
4楼2012-05-09 16:23:06
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hucuiyao

新虫 (小有名气)

我做菌液PCR是要鉴定转化后的阳性克隆,用的是通用引物,是转化大肠杆菌的,94度预变性4分钟,94度45秒,50度45秒,72度1分30秒,31个偱环,长度大约是1200bp的。这个程序大家认为合适吗?这个预变性时间是不是短了点?退火温度不知道是不是也低呢?请各位虫友帮忙分析下,图片当时看的没目的条带,所以也没保存,初做没经验,不好意思噢
yichongweiban
6楼2012-05-10 15:59:54
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