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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 菌液PCR问题
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hucuiyao

新虫 (小有名气)

[交流] 菌液PCR问题 已有10人参与

我做菌液PCR，同学说出来的都是引物二聚体，这是怎么回事呢？
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yichongweiban
1楼 2012-05-09 15:02:31
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

137167741

至尊木虫 (著名写手)
★ ★
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西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-05-09 19:11:41
要说明你为什么做菌液PCR，如果单纯是细菌基因组有该基因，即存在模板，PCR出来都是引物二具体，说明有可能引物不行，有可能是PCR操作有问题；若是连接载体，转化感受态细胞，检验是否有目的基因，可能是由于你转化失败，质粒没有转进去。
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总有一天我要修改用户名。
4楼2012-05-09 16:23:06
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普通回帖

xzx018

铁杆木虫 (著名写手)
★
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上图啊，引物二聚体都在最下面，我的都在100bp以下，在做菌液pcr时先把菌煮沸5min左右，使细胞裂解，当然也有人说预变性时也可以达到这个目的
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2楼2012-05-09 15:06:12
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ysy000000

木虫 (正式写手)
无图无真相哦
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劳其筋骨，饿其体肤。
3楼2012-05-09 15:21:13
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超然渡陈

金虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
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西瓜: 金币+3, 鼓励交流 2012-05-09 19:11:47
楼主应该是用菌液PCR做快速鉴定转化后的阳性克隆吧？所用的引物是你之前克隆基因的引物，还是载体上的通用引物？要把具体情况说清楚而且最好要带图的。假如用的是克隆基因时的引物，做菌落PCR或者菌液PCR没有目的条带而出现引物二聚体可以大概说明是假阳性。要是用的通用引物或者其它新的引物，可能是你退火温度没选好或者其它一些原因，但是不能肯定是假阳性。另外需要说明的是做酵母菌落或者菌液PCR要提前煮沸，因为酵母有细胞壁，预变性和变性不能使壁完全破碎，而一般的细菌就不用预先煮沸。
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5楼2012-05-09 17:10:37
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hucuiyao

新虫 (小有名气)
我做菌液PCR是要鉴定转化后的阳性克隆，用的是通用引物，是转化大肠杆菌的，94度预变性4分钟，94度45秒，50度45秒，72度1分30秒，31个偱环，长度大约是1200bp的。这个程序大家认为合适吗？这个预变性时间是不是短了点？退火温度不知道是不是也低呢？请各位虫友帮忙分析下，图片当时看的没目的条带，所以也没保存，初做没经验，不好意思噢
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yichongweiban
6楼2012-05-10 15:59:54
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一氧化氮

新虫 (初入文坛)
★
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预变性温度可调至97-96度，退火温度适当升高，57-60度尝试一下
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7楼2012-05-10 21:25:33
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jiangly

木虫 (小有名气)
★
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拿菌液做模板之前，先吸到PCR管20微升里用PCR仪煮一下， 95度15min即可，煮过的菌液用做模板。
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8楼2012-05-11 08:48:47
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damaomao

禁虫 (正式写手)
★
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9楼2012-05-11 09:11:20
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xiaoli8609

银虫 (小有名气)
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小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-14 13:39:01
菌液PCR采用的条件应该和你当初克隆这个目的片段的条件是一样的，如果没有目的片段，可以适当降低退火温度再试试，如果不行就凶多吉少了，另外，建议你做的时候加上阳性对照，检测是不是菌液模板有问题，祝好运！
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10楼2012-05-11 09:29:03
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