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hucuiyao

新虫 (小有名气)

[交流] 菌液PCR问题 已有10人参与

我做菌液PCR,同学说出来的都是引物二聚体,这是怎么回事呢?
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yichongweiban
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至尊木虫 (著名写手)

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西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-05-09 19:11:41
要说明你为什么做菌液PCR,如果单纯是细菌基因组有该基因,即存在模板,PCR出来都是引物二具体,说明有可能引物不行,有可能是PCR操作有问题;若是连接载体,转化感受态细胞,检验是否有目的基因,可能是由于你转化失败,质粒没有转进去。
总有一天我要修改用户名。
4楼2012-05-09 16:23:06
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xzx018

铁杆木虫 (著名写手)


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上图啊,引物二聚体都在最下面,我的都在100bp以下,在做菌液pcr时先把菌煮沸5min左右,使细胞裂解,当然也有人说预变性时也可以达到这个目的
2楼2012-05-09 15:06:12
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ysy000000

木虫 (正式写手)

无图无真相哦
劳其筋骨,饿其体肤。
3楼2012-05-09 15:21:13
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超然渡陈

金虫 (小有名气)

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西瓜: 金币+3, 鼓励交流 2012-05-09 19:11:47
楼主应该是用菌液PCR做快速鉴定转化后的阳性克隆吧?所用的引物是你之前克隆基因的引物,还是载体上的通用引物?要把具体情况说清楚而且最好要带图的。假如用的是克隆基因时的引物,做菌落PCR或者菌液PCR没有目的条带而出现引物二聚体可以大概说明是假阳性。要是用的通用引物或者其它新的引物,可能是你退火温度没选好或者其它一些原因,但是不能肯定是假阳性。另外需要说明的是做酵母菌落或者菌液PCR要提前煮沸,因为酵母有细胞壁,预变性和变性不能使壁完全破碎,而一般的细菌就不用预先煮沸。
5楼2012-05-09 17:10:37
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hucuiyao

新虫 (小有名气)

我做菌液PCR是要鉴定转化后的阳性克隆,用的是通用引物,是转化大肠杆菌的,94度预变性4分钟,94度45秒,50度45秒,72度1分30秒,31个偱环,长度大约是1200bp的。这个程序大家认为合适吗?这个预变性时间是不是短了点?退火温度不知道是不是也低呢?请各位虫友帮忙分析下,图片当时看的没目的条带,所以也没保存,初做没经验,不好意思噢
yichongweiban
6楼2012-05-10 15:59:54
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一氧化氮

新虫 (初入文坛)


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预变性温度可调至97-96度,退火温度适当升高,57-60度尝试一下
7楼2012-05-10 21:25:33
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jiangly

木虫 (小有名气)


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拿菌液做模板之前,先吸到PCR管20微升里用PCR仪煮一下, 95度15min即可,煮过的菌液用做模板。
8楼2012-05-11 08:48:47
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damaomao

禁虫 (正式写手)


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9楼2012-05-11 09:11:20
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xiaoli8609

银虫 (小有名气)

★ ★ ★
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小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-14 13:39:01
菌液PCR采用的条件应该和你当初克隆这个目的片段的条件是一样的,如果没有目的片段,可以适当降低退火温度再试试,如果不行就凶多吉少了,另外,建议你做的时候加上阳性对照,检测是不是菌液模板有问题,祝好运!
10楼2012-05-11 09:29:03
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