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593318518

新虫 (小有名气)

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[求助] 载体酶切连接

这个问题已经要把握折磨死了，已经第四次失败了....
载体5.4Kb，使用XhoI酶切（50ul 体系，5ul 酶，3ug DNA， 5小时 37度，NEB 新购的酶），插入片段大小为1k。最初我使用1%的gel来cut片段，后来怕线性的未切割的和supercoil不能分离冲锋而造成割胶时候的误差后来换成0.6%的gel。我特意使用从gel上割下的载体直接电转移TOP 10 Electrocompetent cell，来验证载体是否酶切完全。神啊，每次都是超多的克隆。结果我的载体酶连control自然也是很多克隆。我特意还将酶连产物进行了跑胶，只有两条带：载体和插入物。我也跑了载体切割前后的样品，线性载体快于supercoil，但蛮近。而且线性载体那条lane只有一条带，所以应该没有污染啊。
烦死了，求助啊...即使告诉我怎么让supercoil和线性载体跑的很开的办法也好。
顺便说下我的载体无论是用CIP还是antarctic phosphatase都试过

[ Last edited by 593318518 on 2012-5-3 at 09:17 ]

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1楼 2012-05-03 09:13:56

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引用回帖:

3楼: Originally posted by susizheng at 2012-05-03 11:07:13:
单酶切载体回收后转化感受态验证是否酶切完全，意义不大，细胞都有修复功能，转化后可以重新环化的。个人认为载体想要酶切完全，可以每个酶切体系少加载体量（ug级以下），酶切时间长点更好。
另外不知道你去磷酸 ...

酶连体系？ 2T0ul总体积，1ulT4， insert：vector=1:3，总浓度10ng/ul，2ul 10x buffer