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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 载体酶切连接
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593318518

新虫 (小有名气)

[求助] 载体酶切连接

这个问题已经要把握折磨死了，已经第四次失败了....
载体5.4Kb， 使用XhoI酶切（50ul 体系，5ul 酶，3ug DNA， 5小时 37度，NEB 新购的酶），插入片段大小为1k。最初我使用1%的gel来cut片段，后来怕线性的未切割的和supercoil不能分离冲锋而造成割胶时候的误差后来换成0.6%的gel。我特意使用从gel上割下的载体直接电转移TOP 10 Electrocompetent cell， 来验证载体是否酶切完全。神啊，每次都是超多的克隆。结果我的载体酶连control自然也是很多克隆。我特意还将酶连产物进行了跑胶，只有两条带：载体和插入物。我也跑了载体切割前后的样品，线性载体快于supercoil，但蛮近。而且线性载体那条lane只有一条带，所以应该没有污染啊。
烦死了，求助啊...即使告诉我怎么让supercoil和线性载体跑的很开的办法也好。
顺便说下我的载体无论是用CIP还是antarctic phosphatase都试过

[ Last edited by 593318518 on 2012-5-3 at 09:17 ]
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1楼 2012-05-03 09:13:56
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hyacinth326

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-05-03 13:50:11
593318518: 金币+10 2012-05-08 09:21:14
为什么是电转啊？电转的话，线性的也能进入细胞啊，而这些感受态细胞都是经过改造的，可能会修复一些质粒，这样长菌落很正常啊，而且线性条带应该比超螺旋的慢才对啊
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2楼2012-05-03 09:17:43
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-05-03 13:50:26
单酶切载体回收后转化感受态验证是否酶切完全，意义不大，细胞都有修复功能，转化后可以重新环化的。个人认为载体想要酶切完全，可以每个酶切体系少加载体量（ug级以下），酶切时间长点更好。
另外不知道你去磷酸化是怎么做的？
另外没连上，酶连体系也很重要。
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Thank-you，so-blue.
3楼2012-05-03 11:07:13
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593318518

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by hyacinth326 at 2012-05-03 09:17:43:
为什么是电转啊？电转的话，线性的也能进入细胞啊，而这些感受态细胞都是经过改造的，可能会修复一些质粒，这样长菌落很正常啊，而且线性条带应该比超螺旋的慢才对啊

电转比较快，不需要等吗，呵呵
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4楼2012-05-03 21:57:56
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593318518

新虫 (小有名气)
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3楼: Originally posted by susizheng at 2012-05-03 11:07:13:
单酶切载体回收后转化感受态验证是否酶切完全，意义不大，细胞都有修复功能，转化后可以重新环化的。个人认为载体想要酶切完全，可以每个酶切体系少加载体量（ug级以下），酶切时间长点更好。
另外不知道你去磷酸 ...

按照他的酶的质量标准1U1h可以完全切割1ugDNA了，我的都几百U了。去磷酸化使用CIP的时候是跟酶切一道的，1ul。用antarctic phosphatase是酶切完加了它的buffer后再加1ul酶。T4连接是在RT下1h，够长吧。16度过夜也试过。而且我的T4是高浓度的，全都是新的...
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5楼2012-05-03 22:03:09
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593318518

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by susizheng at 2012-05-03 11:07:13:
单酶切载体回收后转化感受态验证是否酶切完全，意义不大，细胞都有修复功能，转化后可以重新环化的。个人认为载体想要酶切完全，可以每个酶切体系少加载体量（ug级以下），酶切时间长点更好。
另外不知道你去磷酸 ...

酶连体系？ 2T0ul总体积，1ulT4， insert：vector=1:3， 总浓度10ng/ul，2ul 10x buffer
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6楼2012-05-03 22:13:41
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593318518

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by hyacinth326 at 2012-05-03 09:17:43:
为什么是电转啊？电转的话，线性的也能进入细胞啊，而这些感受态细胞都是经过改造的，可能会修复一些质粒，这样长菌落很正常啊，而且线性条带应该比超螺旋的慢才对啊

还有线性确实比超螺旋快....囧
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7楼2012-05-03 22:18:11
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

【答案】应助回帖

★
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-05-04 13:43:27
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6楼: Originally posted by 593318518 at 2012-05-03 22:13:41:
酶连体系？ 2T0ul总体积，1ulT4， insert：vector=1:3， 总浓度10ng/ul，2ul 10x buffer

一般insert比重大更有利于连接，我记得insert：vector=1~5，个人经验是这个比重越大越好，片段比重加多没坏处。载体加多了会酶切不完全，假阳性多，没啥好处。
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Thank-you，so-blue.
8楼2012-05-03 22:19:07
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593318518

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by susizheng at 2012-05-03 22:19:07:
一般insert比重大更有利于连接，我记得insert：vector=1~5，个人经验是这个比重越大越好，片段比重加多没坏处。载体加多了会酶切不完全，假阳性多，没啥好处。

实验室博后说单酶切比重大了会导致插入片段自连后再插入，其实1:5我也试过，不行。话说为什么线性跑的比超螺旋快
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9楼2012-05-03 22:27:53
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

【答案】应助回帖

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593318518: 金币+20 2012-05-08 09:21:05
引用回帖:
9楼: Originally posted by 593318518 at 2012-05-03 22:27:53:
实验室博后说单酶切比重大了会导致插入片段自连后再插入，其实1:5我也试过，不行。话说为什么线性跑的比超螺旋快

的确有这个问题。
线性应该比超螺旋慢才对。质粒有不同的形态存在，一般质粒电泳能看到三条带，你的线性跑的快，可能是你的质粒形态不一定是超螺旋。只能这么解释了。
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Thank-you，so-blue.
10楼2012-05-04 08:44:42
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