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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 引物加保护碱基
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oceanworld

木虫 (小有名气)

[求助] 引物加保护碱基

各位大侠请问一下，我要做双酶切，设计了一对引物加了保护碱基和酶切位点，但是却扩增不出正确的目的片段，用没加保护碱基和酶切位点的引物能够扩增出正确的目的片段，请问这是怎么回事呢？下面是我设计的加了保护碱基和酶切位点的引物！谢谢各位了！


5’  CCGCTCGAGACTTTTGGCCAGCTGCCTCT 3’    xhoI
5’  CCCAAGCTTATCATCAACAGGGAACTGTTG 3’     HindIII
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1楼 2012-03-30 17:40:49
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ilaveu

木虫 (著名写手)
★ ★
amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流！欢迎发表更多的见解！ 2012-03-30 20:15:52
看着设计上没什么问题，如果引物没问题的话，应该能P出来才对
PCR有时候就是不稳定，高手也常常遇到P不出来的情况，换个条件就能出来
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2楼2012-03-30 19:16:35
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oceanworld

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ilaveu at 2012-03-30 19:16:35:
看着设计上没什么问题，如果引物没问题的话，应该能P出来才对
PCR有时候就是不稳定，高手也常常遇到P不出来的情况，换个条件就能出来

谢谢，我在换个条件试试
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3楼2012-03-31 08:28:49
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lincy2010

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhaohq1209: 金币+2, 有道理，先连在T载体删，然后再酶切，就不存在保护碱基的问题了 2012-03-31 21:33:47
oceanworld: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-04-01 08:13:15
其实你既然有没加保护碱基的引物，并且能P得很好，可以考虑直接连在平端载体上，比如通过T/A克隆连在T载体上，再切下来
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耐得住寂寞，方能遇见繁华
4楼2012-03-31 19:47:58
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怎么都行

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
oceanworld: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-04-01 08:13:24
解决方案1：采用两步法PCR，前5个循环退火温度采用不加酶切位点时的引物退火温度（Ta opt），待扩增出部分PCR产物片段后，后25个循环再用加酶切位点后引物的退火温度。
解决方案2：先用不加酶切位点的引物扩出产物，将产物至少稀释100倍，做第2轮PCR的模板，第2轮PCR用带酶切位点的引物对扩增。
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5楼2012-04-01 01:46:34
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huguangdong

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
oceanworld: 金币+2, ★有帮助 2012-04-02 15:37:40
你的问题以我的经验绝对是做的问题，不会因为加了酶切位点和保护碱基而扩增有问题，当然你必须明白一下几个问题：1 模板是质粒还是基因组，如果是基因组的话有可能会出现扩增有误的现象，但是几率也很小。2 做一个梯度，筛选一个退火温度，不过据我经验，加了酶切位点和保护碱基的引物退火温度和不加这两个的原始引物退火温度相同即可。3 注意使用好的PCR相关试剂，别用便宜不稳定的产品，这也很能影响扩增效果。4 注意PCR中的延伸时间设置，TAQ酶和高保真酶的延伸时间是不一样的，根据自己目的片段长度来设置。
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6楼2012-04-01 09:14:08
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分子菜鸟

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
oceanworld: 金币+2, ★有帮助 2012-04-02 15:37:51
先用没有酶切位点的做一轮PCR，产物稀释一定倍数（几十至一百）再作为模板做第二轮PCR就可以了。
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7楼2012-04-01 11:07:42
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yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

我的经验是换个酶吧，一酶降一基因！真的是这样！！！！
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8楼2013-04-01 22:04:09
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