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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 引物加保护碱基
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oceanworld

木虫 (小有名气)

[求助] 引物加保护碱基

各位大侠请问一下，我要做双酶切，设计了一对引物加了保护碱基和酶切位点，但是却扩增不出正确的目的片段，用没加保护碱基和酶切位点的引物能够扩增出正确的目的片段，请问这是怎么回事呢？下面是我设计的加了保护碱基和酶切位点的引物！谢谢各位了！


5’  CCGCTCGAGACTTTTGGCCAGCTGCCTCT 3’    xhoI
5’  CCCAAGCTTATCATCAACAGGGAACTGTTG 3’     HindIII
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1楼 2012-03-30 17:40:49
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lincy2010

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhaohq1209: 金币+2, 有道理，先连在T载体删，然后再酶切，就不存在保护碱基的问题了 2012-03-31 21:33:47
oceanworld: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-04-01 08:13:15
其实你既然有没加保护碱基的引物，并且能P得很好，可以考虑直接连在平端载体上，比如通过T/A克隆连在T载体上，再切下来
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耐得住寂寞，方能遇见繁华
4楼2012-03-31 19:47:58
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ilaveu

木虫 (著名写手)
★ ★
amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流！欢迎发表更多的见解！ 2012-03-30 20:15:52
看着设计上没什么问题，如果引物没问题的话，应该能P出来才对
PCR有时候就是不稳定，高手也常常遇到P不出来的情况，换个条件就能出来
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2楼2012-03-30 19:16:35
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oceanworld

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ilaveu at 2012-03-30 19:16:35:
看着设计上没什么问题，如果引物没问题的话，应该能P出来才对
PCR有时候就是不稳定，高手也常常遇到P不出来的情况，换个条件就能出来

谢谢，我在换个条件试试
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3楼2012-03-31 08:28:49
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怎么都行

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
oceanworld: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-04-01 08:13:24
解决方案1：采用两步法PCR，前5个循环退火温度采用不加酶切位点时的引物退火温度（Ta opt），待扩增出部分PCR产物片段后，后25个循环再用加酶切位点后引物的退火温度。
解决方案2：先用不加酶切位点的引物扩出产物，将产物至少稀释100倍，做第2轮PCR的模板，第2轮PCR用带酶切位点的引物对扩增。
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5楼2012-04-01 01:46:34
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