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oceanworld

木虫 (小有名气)

应助: 1 (幼儿园)
金币: 2274.6
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红花: 1
帖子: 255
在线: 87.8小时
虫号: 831030
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性别: GG
专业: 发育生物学

[求助] 引物加保护碱基

各位大侠请问一下，我要做双酶切，设计了一对引物加了保护碱基和酶切位点，但是却扩增不出正确的目的片段，用没加保护碱基和酶切位点的引物能够扩增出正确的目的片段，请问这是怎么回事呢？下面是我设计的加了保护碱基和酶切位点的引物！谢谢各位了！

5’ CCGCTCGAGACTTTTGGCCAGCTGCCTCT 3’ xhoI
5’ CCCAAGCTTATCATCAACAGGGAACTGTTG 3’ HindIII

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1楼 2012-03-30 17:40:49

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

怎么都行

银虫 (小有名气)

BioEPI: 2
应助: 21 (小学生)
金币: 591.8
散金: 45
帖子: 229
在线: 38.2小时
虫号: 1050090
注册: 2010-06-30
性别: GG
专业: 生物大分子结构与功能

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
oceanworld: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-04-01 08:13:24

解决方案1：采用两步法PCR，前5个循环退火温度采用不加酶切位点时的引物退火温度（Ta opt），待扩增出部分PCR产物片段后，后25个循环再用加酶切位点后引物的退火温度。
解决方案2：先用不加酶切位点的引物扩出产物，将产物至少稀释100倍，做第2轮PCR的模板，第2轮PCR用带酶切位点的引物对扩增。