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oceanworld

木虫 (小有名气)

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[求助] 引物加保护碱基

各位大侠请问一下，我要做双酶切，设计了一对引物加了保护碱基和酶切位点，但是却扩增不出正确的目的片段，用没加保护碱基和酶切位点的引物能够扩增出正确的目的片段，请问这是怎么回事呢？下面是我设计的加了保护碱基和酶切位点的引物！谢谢各位了！

5’ CCGCTCGAGACTTTTGGCCAGCTGCCTCT 3’ xhoI
5’ CCCAAGCTTATCATCAACAGGGAACTGTTG 3’ HindIII

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1楼 2012-03-30 17:40:49

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

huguangdong

至尊木虫 (职业作家)

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【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
oceanworld: 金币+2, ★有帮助 2012-04-02 15:37:40

你的问题以我的经验绝对是做的问题，不会因为加了酶切位点和保护碱基而扩增有问题，当然你必须明白一下几个问题：1 模板是质粒还是基因组，如果是基因组的话有可能会出现扩增有误的现象，但是几率也很小。2 做一个梯度，筛选一个退火温度，不过据我经验，加了酶切位点和保护碱基的引物退火温度和不加这两个的原始引物退火温度相同即可。3 注意使用好的PCR相关试剂，别用便宜不稳定的产品，这也很能影响扩增效果。4 注意PCR中的延伸时间设置，TAQ酶和高保真酶的延伸时间是不一样的，根据自己目的片段长度来设置。