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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » western blot中蛋白质转印问题
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lywac

铜虫 (小有名气)

[求助] western blot中蛋白质转印问题

请教各位虫友，在western blotting中蛋白转印后，mark不清楚，是什么原因？另外，请教各位，你们做的时候，电流、电压分别多大？给个参考，先行谢过啦
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等你，是我一生的承诺
1楼 2011-12-28 17:02:20
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caozi

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜(金币+3): Good！ 2011-12-31 22:07:34
西瓜: 回帖置顶 2011-12-31 22:07:35
marker上面不同分子量大小的条带转膜的速度是不一样的，小分子量的条带会先转过去，大分子量的条带转膜时间较长，你看看你的目的蛋白的分子量是多少，在你的目的蛋白分子量附近的两条marker带是留在了凝胶上还是已经转到第二张膜上了，再做分析
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12楼2011-12-31 11:10:44
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普通回帖

neon_alone

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜(金币+1): good 2011-12-29 17:44:08
marker不清楚，你确定在转膜缓冲液加甲醇了吗？膜之前也要拿甲醇活化5-10秒钟
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2楼2011-12-29 14:15:28
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necilyx

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wanhscn(金币+2): 鼓励应助！ 2011-12-30 09:24:14
在转膜过程中，110mA恒流，90min，是不是转膜时间不够啊？一般来说小分子蛋白20kd一下转膜45min就可以，分子量大一些的90min就可以了。另外，转膜时，胶和膜贴在一起后尽量别在移动，不然条带不清楚，影响结果。
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聪明才智要为意外做准备~~
3楼2011-12-29 15:13:18
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ljw796

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
wanhscn(金币+1): 鼓励交流！ 2011-12-30 09:24:21
能否说下你的实验步骤，以便于大家分析？
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4楼2011-12-29 16:13:39
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lywac

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by neon_alone at 2011-12-29 14:15:28:
marker不清楚，你确定在转膜缓冲液加甲醇了吗？膜之前也要拿甲醇活化5-10秒钟

这些都做过了
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等你，是我一生的承诺
5楼2011-12-29 22:21:09
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lywac

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by necilyx at 2011-12-29 15:13:18:
在转膜过程中，110mA恒流，90min，是不是转膜时间不够啊？一般来说小分子蛋白20kd一下转膜45min就可以，分子量大一些的90min就可以了。另外，转膜时，胶和膜贴在一起后尽量别在移动，不然条带不清楚，影响结果。

我怕是转膜转过了
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等你，是我一生的承诺
6楼2011-12-29 22:21:55
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will5252

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
lywac(金币+5): ★有帮助 谢谢回帖，我用的是湿转，有可能是膜没有压紧 2011-12-30 12:42:21
转膜一般80V恒压2.5小时或者100v恒压1.5小时，一般80V的时候电流在200多一点，100V的时候电流在将近300。你的mark不清楚可能是因为胶和膜没有压紧，也有可能转膜电压和时间有问题。（我说的是湿转，不知道楼主用的半干转还是湿转）
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7楼2011-12-30 09:46:08
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ypmaok

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
lywac(金币+5): 2011-12-30 12:52:28
现在一般都是用PVDF膜，一般不存在转不转过的问题。比如我们现在湿转一般是100V恒压1.5小时，有时候也会2小时。可以在转之前用丽春红适当染色，看一下在凝胶中Marker是否清晰，作为转膜前的参照。看你的情况，很可能你的原因是膜没有压紧，或者是转膜不充分，电流或电压过小或转膜时间不够。
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8楼2011-12-30 10:53:05
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lywac

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by ypmaok at 2011-12-30 10:53:05:
现在一般都是用PVDF膜，一般不存在转不转过的问题。比如我们现在湿转一般是100V恒压1.5小时，有时候也会2小时。可以在转之前用丽春红适当染色，看一下在凝胶中Marker是否清晰，作为转膜前的参照。看你的情况，很可 ...

我加了两块膜放在一侧一起转了一下，发现第二块膜上面也有mark，染色后也有条带，用的是80mA恒流转1.5小时。
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等你，是我一生的承诺
9楼2011-12-30 12:45:37
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lywac

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by ypmaok at 2011-12-30 10:53:05:
现在一般都是用PVDF膜，一般不存在转不转过的问题。比如我们现在湿转一般是100V恒压1.5小时，有时候也会2小时。可以在转之前用丽春红适当染色，看一下在凝胶中Marker是否清晰，作为转膜前的参照。看你的情况，很可 ...

我用两块膜在一侧一起转试了一下，转完后发现第二块膜上面也有较为清晰的mark，染色后有大分子的条带，用的是80mA恒流1.5小时，凝胶上面的mark确实不太清晰
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等你，是我一生的承诺
10楼2011-12-30 12:51:33
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